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1材料與方法
1.1材料煙草青枯病土壤取自貴州省煙草科學(xué)研究所福泉煙草青枯病病圃。五點混合法采集土壤樣品，取土壤表層8~20cm的土層，過0.2mm篩，去除雜質(zhì)。微生物保守區(qū)域片段的擴(kuò)增引物（表1）由上海生工生物有限公司合成；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、DNAMarker、dNTPs、DNA聚合酶、連接酶、克隆載體等試劑購自大連寶生物（TAKARA）有限公司；序列測定由上海生工生物有限公司完成。
1.2方法
1.2.1土壤總DNA的提取和檢測采用玻璃珠均質(zhì)和液氮研磨法相結(jié)合以及SDS-CTAB法，提取病圃土壤中微生物DNA，用純化試劑盒純化獲得DNA。采用瓊脂糖凝膠電泳法檢測土壤微生物總DNA和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
1.2.2PCR擴(kuò)增與DNA純化以土壤微生物總DNA為模板，8f，926r；338F，518R為引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系總體積為25.0μL，其中模板（土壤DNA）1.0μL，正向引物和反向引物（10μmol/μL）各1.0μL，10×PCRBuffer（含有Mg2+）2.5μL，dNTP（2.5mmol/μL）1.0μL，Taq（5U/μL）0.2μL，蒸餾水補(bǔ)體積至25.0μL；反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min；94℃變性40s，55℃變性50s，72℃延伸1min，32個循環(huán)；最后，72℃延伸10min。按照TAKARA公司凝膠回收試劑盒說明書操作，對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收，用瓊脂糖凝膠電泳檢測回收產(chǎn)物。
1.2.3微生物多樣性初步分析保守區(qū)域文庫中檢測為陽性的單克隆由上海生工生物公司測序。獲得的序列信息通過NCBI數(shù)據(jù)庫(ncbi.nlm.nih.gov)及EzTaxon網(wǎng)站()進(jìn)行在線分析和比對。
2結(jié)果與分析
2.1煙草青枯病土壤微生物總DNA提取瓊脂糖凝膠電泳檢測提取純化后的土壤微生物總DNA，結(jié)果顯示提取的DNA大小約在2.0~10.0kb范圍之間，通過DNA試劑盒的純化，可以降低土壤中腐植酸以及多酚類等化合物對PCR反應(yīng)的影響。2.2煙草青枯病土壤微生物16S-rRNA和ITS保守序列文庫構(gòu)建以純化的DNA為模板，用細(xì)菌特異性8f和926r引物、真菌特異性338F和518R引物，經(jīng)過PCR擴(kuò)增，獲得與預(yù)期片段大小一致的條帶，分別在1000bp和300bp左右。分別用8f，926r引物；338F，518R引物擴(kuò)增的產(chǎn)物構(gòu)建文庫，從文庫中隨機(jī)挑取部分單菌落，用PCR方法檢測其攜帶的片段，部分瓊脂糖電泳檢測結(jié)果如圖所示，圖1表明隨機(jī)挑取的大多數(shù)單菌落攜帶有目的條帶。陽性克隆的序列的測定由上海生工生物有限公司完成。
1.新技術(shù)在環(huán)境工程生物處理研究中的應(yīng)用
由于PCR-DGGE技術(shù)克服了傳統(tǒng)微生物學(xué)方法的局限性，自Muvzer等開辟了DGGE在微生物生態(tài)領(lǐng)域研究的先河以來，該技術(shù)迅速發(fā)展成為環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)分析研究的主要手段之一。近年來，DGGE 用于環(huán)境微生物種群的研究越來越多，涉及的領(lǐng)域也越來越廣泛，在國外DGGE技術(shù)已經(jīng)被廣泛用于活性污泥、生物膜等生物處理系統(tǒng)中的微生物多樣性檢測、微生物鑒定以及種群演替等方面的研究，在國內(nèi)這方面的應(yīng)用雖然處于起步階段，但也成為研究的熱點。
1．1在廢水生物處理研究中的應(yīng)用
PCR-DGGE技術(shù)在廢水生物處理研究中的應(yīng)用使人們對廢水處理過程中微生物群落的變化產(chǎn)生了新的認(rèn)識。
Lapara等研究了升高溫度對廢水好氧生物處理過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和功能的影響，DGGE分析細(xì)菌群落的結(jié)果表示不同溫度下有不同的細(xì)菌群落。
應(yīng)用PCR-DGGE方法，對在相同的操作條件下分別用低溫菌和常溫菌接種的兩套活性污泥系統(tǒng)中的微生物群落結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化進(jìn)行了追蹤。由于工藝相同，使得接種的低溫菌群和常溫菌群在相同的操作條件下，產(chǎn)生了相似的微生物群落結(jié)構(gòu)。隨著運(yùn)行時間的增加，其菌群結(jié)構(gòu)相似程度也越來越高。
硝化作用是廢水處理系統(tǒng)中實現(xiàn)氨氮去除的關(guān)鍵步驟。而氨氧化細(xì)菌在硝化作用過程中負(fù)責(zé)將氨氧化為亞硝酸鹽，實現(xiàn)亞硝化作用，是硝化過程中必不可少的步驟。但由于氨氧化細(xì)菌的生長速率相當(dāng)?shù)?，生物量很少，采用傳統(tǒng)的細(xì)菌分離培養(yǎng)分析法研究氨氧化細(xì)菌相當(dāng)費(fèi)時、繁瑣。許玫英等采用PCR擴(kuò)增16SrDNA、擴(kuò)增功能基因、隨機(jī)克隆測序等技術(shù)，分析處理含高濃度氨氮廢水處理系統(tǒng)不同馴化時期的4個活性污泥樣品氨氧化細(xì)菌的種類和氨單加氧酶的活性，并在國內(nèi)首次采用PCR-DGGE相結(jié)合的技術(shù)對樣品中總的細(xì)菌類群的差異進(jìn)行研究。結(jié)果表明采用PCR-DGGE技術(shù)有利于更全面地了解氨氧化細(xì)菌的類群和功能，進(jìn)而改善廢水處理系統(tǒng)的處理效果。
應(yīng)用PCR-DGGE技術(shù)對城市污水化學(xué)一生物絮凝強(qiáng)化一級處理工藝與傳統(tǒng)的完全混合式處理工藝反應(yīng)池活性污泥樣品微生物種群結(jié)構(gòu)進(jìn)行了對比研究，對同一反應(yīng)器不同位置微生物分布以及不同工況下的微生物種群結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步探討。結(jié)果表明兩種城市污水處理工藝中微生物種群多樣性都相當(dāng)豐富，但是種群結(jié)構(gòu)相差很大。說明化學(xué)生物絮凝處理工藝的微生物作用與成分相近的城市污水處理工藝中微生物作用機(jī)理可能存在相當(dāng)大的差別。
R0wan等采用生物滴濾反應(yīng)器和生物濾池處理同種廢水，運(yùn)用PCR-DGGE考察了不同反應(yīng)器中的氨氧化細(xì)菌菌群的組成。雖然不同形式反應(yīng)器或是同一反應(yīng)器的不同位置中的氨氧化細(xì)菌菌群組成不同，但是主要種群是不依賴反應(yīng)器的形式或是在反應(yīng)器中所處的位置不同而改變的，也正是這些主要種群在整個處理過程中發(fā)揮著重要的作用。
采用PcR-DGGE技術(shù)對處理采油廢水的水解酸化一缺氧法不同生物反應(yīng)器中污泥樣品進(jìn)行研究，確定了微生物的優(yōu)勢菌種，并進(jìn)行了多樣性分析，結(jié)果顯示了在不同環(huán)境條件下微生物群落結(jié)構(gòu)的連續(xù)動態(tài)變化過程。
1．2 在廢氣生物處理研究中的應(yīng)用
生物過濾是一種能有效處理惡臭和揮發(fā)性有機(jī)廢氣的氣體污染控制技術(shù)。生物濾池和生物濾塔作為生物處理惡臭氣體的簡單有效的方法，得到了快速的發(fā)展。
采用PCR-DGGE技術(shù)研究除臭生物濾池中試裝置中分別一處于較強(qiáng)酸性和中性的兩種不同運(yùn)行環(huán)境下微生物種群的多樣性和生物種群的結(jié)構(gòu)變化。通過擴(kuò)增細(xì)菌16SrRNA基因的V3可變區(qū)，結(jié)合應(yīng)用DGGE技術(shù)分析除臭生物濾池的生物種群的結(jié)構(gòu)變化，并回收主要的DN段，結(jié)合PCR測序及T載體克隆測序，明確優(yōu)勢菌群的系統(tǒng)發(fā)育地位。結(jié)果表明，除臭生物濾池在不同的口H條件下，微生物的多樣性及其豐度存在較大差別，強(qiáng)酸性對微生物具有較高的選擇作用，與中性條件相比 微生物種群多樣性相對較低。同時在濾池的不同層次上也表現(xiàn)出明顯的空間分布多樣性差異，序列比對結(jié)果顯示硫氧化細(xì)菌在除臭過程中占有優(yōu)勢地位。為更好地處理惡臭氣體提供可靠的科學(xué)依據(jù)，同時也為生物除臭的應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。
生物濾塔中微生物的種群結(jié)構(gòu)以及微生物多樣性對于惡臭氣體的處理效率以及反應(yīng)器的穩(wěn)定運(yùn)行至關(guān)重要。殷峻等應(yīng)用DGGE技術(shù)對處理含氨廢氣的生物濾塔中微生物多樣性隨時間的變化進(jìn)行了研究，通過比較反應(yīng)器不同填料、不同時期微生物多樣性得出結(jié)論：填料中微生物的多樣性都隨著反應(yīng)器運(yùn)行時間的延長而有所減少；與污泥填料和混合填料相比，堆肥填料的微生物多樣性程度最高，反應(yīng)器的去除能力也最好。
1．3 在污泥生物處理研究中的應(yīng)用
在污泥處理過程中，污泥的穩(wěn)定化是…個相當(dāng)重要的過程。微生物的穩(wěn)定化過程對于系統(tǒng)達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)具有更直接的指導(dǎo)意義。傅以鋼等用DGGE指紋圖譜技術(shù)對污泥堆肥工藝中的細(xì)菌種群動態(tài)變化及多樣性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，生物法污泥堆肥周期小于8d。對污泥堆肥各工藝環(huán)節(jié)樣品進(jìn)行DGGE指紋圖譜和相似性系數(shù)Cs值分析，發(fā)現(xiàn)隨著反應(yīng)的持續(xù)進(jìn)行，微生態(tài)結(jié)構(gòu)的Cs值越來越高，說明微生物種群結(jié)構(gòu)愈趨穩(wěn)定。證實污泥微生態(tài)能迅速進(jìn)行優(yōu)勝劣汰的篩選，調(diào)整內(nèi)部細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)，從而達(dá)至 適應(yīng)環(huán)境的目的，在發(fā)酵過程中形成的優(yōu)勢細(xì)菌種群能長時間保持穩(wěn)定。
中圖分類號 X172 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2017）13-0036-03
Study on Soil Microbial Diversity in Heavy Metal Contaminated Soil
Li Yan1 et al.
（1Anhui Huajing Resources and Environment Technology Co.，Ltd.，Hefei 230094，China）
Abstract：In this paper，the research methods of microbial diversity of heavy metal contaminated soils in recent years are summarized，and their advantages and disadvantages and their application are analyzed. The research methods of microbes are also discussed.
Key words：Heavy metal pollution；Soil microbes；Microbial diversity；Research methods
近年來，由于農(nóng)藥、化肥的大量使用，以及冶金、采礦業(yè)的迅猛發(fā)展，土壤重金屬污染日趨嚴(yán)重[1]。重金屬污染不僅會嚴(yán)重影響農(nóng)產(chǎn)品以及農(nóng)作物的品質(zhì)，而且會通過食物鏈進(jìn)入人體，危害人體健康。土壤是微生物棲息的最重要環(huán)境之一，提供了微生物生長所必要的營養(yǎng)物質(zhì)。土壤微生物種類十分豐富，主要分為細(xì)菌、真菌、古菌以及放線菌等。土壤微生物是土壤有機(jī)質(zhì)以及土壤養(yǎng)分C、N、P、S等循環(huán)轉(zhuǎn)化的動力，參與土壤中有機(jī)質(zhì)的分解、腐殖質(zhì)的形成、土壤養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化循環(huán)等[2]。土壤微生物在土壤生態(tài)系統(tǒng)中扮演者十分重要的角色[3]，對環(huán)境的變化反應(yīng)靈敏[4]，其群落多樣性和相對組成，是評價環(huán)境質(zhì)量的重要參數(shù)[5]。一旦土壤生態(tài)系統(tǒng)受到污染，土壤微生物就會發(fā)生相應(yīng)的變化[6]。有研究報告指出，土壤重金屬污染能明顯影響土壤微生物的活性及結(jié)構(gòu)[7]，李晶等[8]研究也表明，土壤微生物對重金屬脅迫特別敏感，可通過微生物群落結(jié)構(gòu)的變化來反映土壤質(zhì)量和健康狀況[9]。因此，研究土壤微生物具有十分重要的意義。本文對研究微生物傳統(tǒng)以及各種新型研究方法進(jìn)行了分類介紹，并對各種方法的優(yōu)缺點以及適用場合進(jìn)行說明。
1 土壤微生物研究方法
1.1 傳統(tǒng)的分離純培養(yǎng)和稀釋平板計數(shù) 在固體瓊脂培養(yǎng)基上接種培養(yǎng)微生物，可利用微生物的表面特征差異，在固體培養(yǎng)基上對微生物進(jìn)行分離純化，也可利用該方法對微生物在平板上進(jìn)行簡單的計數(shù)[10]。同時可以通過配制不同成分的培養(yǎng)基對微生物進(jìn)行篩選馴化，從而得到我們需要的菌種。此種方法的優(yōu)點是成本低，便于對微生物的狀況做出初步的判斷。缺點是由于自然界中存在大量的不可培養(yǎng)的微生物，且存在很多對溫度要求苛刻并微生物，如嗜低溫菌和嗜高溫菌，傳統(tǒng)的固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)溫度并不能滿足這些微生物的生存所需溫度。
1.2 Biolog微平板法 Biolog微平板原理是基于測定微生物對單一碳源利用程度的差異來表征微生物的生理特性[11]。Biolog微平板由對照孔和95種不同單一碳源孔組成并在其中添加染料，當(dāng)接種純培養(yǎng)的菌液時，其中一些孔的營養(yǎng)物質(zhì)被利用，使各孔呈現(xiàn)出不同的顏色，從而形成微生物特有的代謝指紋，可通過與標(biāo)準(zhǔn)菌種的數(shù)據(jù)庫做對比，從而可鑒定出被測菌種。與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法相比，此方法可以估算微生物群落代謝多樣性和功能多樣性。同時可根據(jù)各孔的顏色差異來反映出微生物群落的均勻度，從而可以反映出群落的穩(wěn)定性[12]。該方法的缺點是當(dāng)環(huán)境差異不大時，這些指數(shù)并不能較敏感地區(qū)分菌群之間的差異[13]。同時由于不同的生長和競爭的結(jié)果，菌種之間會相互影響導(dǎo)致種群發(fā)生變化，影響測定結(jié)果[14]。
1.3 磷酸脂肪酸分析法（PLFA） 磷酸脂肪酸存在于活細(xì)胞的細(xì)胞膜中，具有屬的特異性，不同屬的微生物通過不同生化途徑而形成不同的磷酸脂肪酸（PLFAs）[15]。因此，土壤中的PLFAs組成和含量變化在一定程度上可反映土壤中微生物量和群落的動態(tài)變化。通過對微生物的磷酸脂肪酸進(jìn)行提取，并依據(jù)其中的特征脂肪酸指示的微生物種類[16]，可對土壤中微生物群落特征進(jìn)行表征。此種方法具有對試驗條件要求低、無需對微生物進(jìn)行培養(yǎng)、測試功能多和穩(wěn)定性好等優(yōu)點[17]。但PLFA法也具有一定的局限性。該方法只能鑒定到屬，PLFA圖譜并不能給出一個實際的微生物種類組成，僅能反映微生物群落的概圖[18]；另外，該方法容易受微生物生理狀態(tài)影響[19-20]；古菌不能使用PLFA圖譜進(jìn)行分析，因為它的極性脂質(zhì)是以醚而不是以酯鍵的形式出現(xiàn)[21]。同時由于目前尚未建立土樣中所有微生物的特征脂肪酸，并且在很多情況下，還無法確定土樣中某些脂肪酸與特定微生物或微生物群落的對應(yīng)關(guān)系[22]。
1.4 變性梯度凝膠電泳技術(shù)（PCR-DGGE） 該技術(shù)是以復(fù)雜的環(huán)境樣品如土壤為研究對象，直接提取微生物DNA，利用通用引物進(jìn)一步對提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將擴(kuò)增產(chǎn)物開展DGGE凝膠電泳分析[23]。DGGE不是將分子量不同的DNA分開，而是通過聚丙烯酰胺凝膠中變性劑濃度梯度的不同，將序列不同的DNA分開[24]。該方法的原理是根據(jù)DNA的解鏈特性，不同堿基組成的DNA雙螺旋發(fā)生變性所需要的變性劑濃度不同。在普通的聚丙烯酰胺凝膠基礎(chǔ)上加入變性劑，根據(jù)其遷移行為決定于其分子大小和電荷的原理能夠?qū)㈤L度相同但序列不同的DN段區(qū)分開[25]。該方法具有可靠性高、重現(xiàn)性強(qiáng)、方便快捷、分辨率高等優(yōu)點[26]，但同時也存在一定的局限性。DGGE還不能全面分析土壤中全部微生物，該方法只能檢測出土壤中相對豐度大于1%的微生物[27]；同時DGGE對實驗要求較高，凝膠濃度、溫度、電壓等電泳條件選擇不當(dāng)時，就會發(fā)生共遷現(xiàn)象[26]，即同一條帶不止包含一種微生物，微生物的種類被低估。
1.5 高通量測序技術(shù) 高通量測序技術(shù)也稱“下一代”測序技術(shù)，1次并行能對幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測定。以Illumina公司的Solexa，ABI公司的SOLiD，和Roche公司的454技術(shù)為代表[28-29]。該技術(shù)對于研究土壤微生物具有極大的意義。該技術(shù)極大地降低了微生物測序成本，實驗了大規(guī)模土壤微生物直接測序[30]；同時該方法極大地提高了測序通量，豐富了研究的信息量，便于研究者更加深入地了解所研究課題。但同時該方法也存在一定的局限性，主要局限性如下：海量數(shù)據(jù)分析難的問題，該測序方法所測數(shù)據(jù)之深，所獲信息之大，都極大地加大了實驗研究者分析數(shù)據(jù)的難度；數(shù)據(jù)去偽存真難的問題，在土壤微生物高通量測序中，存在物種豐富度被高估的情況[30]，對高通量測序結(jié)果去偽存真，探索新的統(tǒng)計學(xué)方法成為研究者面臨的一大難題[31]。
1.6 基因芯片技術(shù)（GeoChip） 基因芯片（GeoChip）是研究土壤微生物非常有效的技術(shù)手段，作為新一代的核酸雜交技術(shù)，可用于檢測環(huán)境微生物參與物質(zhì)循環(huán)、污染物降解等過程中參與的功能基因[32]。該方法是在芯片上含有編碼各種與生態(tài)學(xué)和生物功能過程或生物降解作用有關(guān)酶的基因[33]。由此可見，功能基因芯片為土壤微生物研究提供了全新有力的技術(shù)分析工具，有利于更加有效地利用微生物對污染土壤進(jìn)行修復(fù)[34]?；蛐酒夹g(shù)具有高密度、高靈敏度、自動化和低背景水平等顯著優(yōu)點[35]。但是任何技術(shù)都存在一定的局限性，基因芯片技術(shù)也不例外。該技術(shù)雖能檢測出微生物在生物學(xué)過程中所發(fā)揮作用的功能基因，但是卻不能直接表征微生物的群落多樣性組成和豐富度。應(yīng)結(jié)合DNA與mRNA測序，可以更加真實全面地反映土壤微生物群落結(jié)構(gòu)信息及其生理活動[34]。同時該方法在取樣、標(biāo)記、雜交條件、圖像處理、數(shù)據(jù)歸一化以及所得數(shù)據(jù)的質(zhì)量評估等都會帶來很多誤差[36]。
2 不同方法在重金屬污染土壤中的應(yīng)用
劉云國等[37]在湖南臨鄉(xiāng)桃林礦區(qū)土壤中采用稀釋涂布法在馬丁固體培養(yǎng)基上篩選出一株高抗銅、鋅菌株；張秀等[38]利用Biolog微平板法來分析生物質(zhì)炭對鎘污染土壤微生物多樣性的影響；孫婷婷等[39]利用磷酸脂肪酸分析法來分析羥基磷灰石-植物聯(lián)合修復(fù)對Cu/Cd污染植物根際土壤微生物群落的影響；鄭涵等[40]利用PCR-DGGE分析方法對鋅脅迫對土壤中微生物群落變化的影響進(jìn)行了評價分析；江玉梅等[41]利用Illumina平臺高通量測序技術(shù)分析重金屬污染對鄱陽湖底泥微生物群落結(jié)構(gòu)的影響；路桃香對植物非根際土壤微生物進(jìn)行454高通量測序。
目前對于微生物研究方法有很多種，有最先進(jìn)的技術(shù)，也有傳統(tǒng)的實驗方法，每種方法都各有優(yōu)缺點，因此，在研究土壤微生物時，應(yīng)結(jié)合土壤特征以及研究目的合理選擇研究方法。如條件允許的情況下，可以結(jié)合多種技術(shù)方法同時使用，可以更好地研究土壤微生物的群落特征。
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中圖分類號：Q938.1+1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）06-1443-04
土壤微生物是森林生態(tài)系統(tǒng)中最重要的組分，在凋落物分解、腐殖質(zhì)合成以及養(yǎng)分循環(huán)等過程中起著十分重要的作用。其種類和組成不僅直接影響土壤的生物化學(xué)循環(huán)，而且是土壤生物活性的具體體現(xiàn)，并在森林生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動中扮演著重要角色[1-3]。不同土壤分布著不同的土壤微生物，而不同的微生物多樣性又影響土壤功能的多樣性[4]。土壤微生物的組成和分布可以在深層次上揭示森林生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動。目前測定土壤微生物多樣性的方法主要有稀釋平板法、磷脂脂肪酸分析（PFLA）法、Biolog微平板分析法及分子生物學(xué)方法等[5]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)在土壤微生物研究中的不斷發(fā)展，土壤微生物多樣性的研究有了新的突破。核糖體ITS區(qū)為非編碼區(qū)，受到的選擇壓力較小，進(jìn)化速度快。因此該區(qū)段能夠提供比較豐富的變異位點和信息位點，目前已經(jīng)用于種間、亞種和種群水平上的遺傳多樣性研究[6]。自從Innis等[7]1990年首先設(shè)計ITS引物對真菌核內(nèi)核糖體RNA基因進(jìn)行擴(kuò)增以來，ITS序列分析技術(shù)在真菌分類、鑒定的研究中應(yīng)用越來越廣泛。
該研究利用分子生物學(xué)技術(shù)對長白山自然保護(hù)區(qū)不同森林類型的土壤真菌群落組成進(jìn)行分析，比較不同植被類型與土壤真菌之間的關(guān)系及變化趨勢，以期加深對土壤真菌變化過程和機(jī)制的認(rèn)識，為長白山區(qū)域天然林保護(hù)和生態(tài)建設(shè)提供基礎(chǔ)資料。
1 材料與方法
1.1 材料
土壤樣品于2010年10月采自長白山自然保護(hù)區(qū)（表1）。按不同林型采用對角線型混合取樣法采集表層的土壤，采集深度為0～5 cm，用塑料袋封裝帶回。-80 ℃下密封保存。
1.2 試劑與儀器
Taq DNA 聚合酶、dNTPs、限制性內(nèi)切酶Hinf Ⅰ購自寶生物工程（大連）有限公司；土壤真菌基因組提取試劑盒購自MoBio Laboratories公司；DNA純化試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。Gene-9700型PCR擴(kuò)增儀、上海盧湘儀臺式離心機(jī)、BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)等。
1.3 方法
1.3.1 土壤樣品DNA的提取與檢測 土壤樣品DNA的提取參照MoBio土壤真菌提取試劑盒的方法。
1.3.2 ITS-PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物純化 用于ITS片段擴(kuò)增的引物采用真菌ITS區(qū)通用引物ITS1-F和ITS4，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，具體序列如下：ITS1-F（5′3′）：CTTGGTCATTTAGAGG
AAGTAA；ITS4（5′3′）：TCCTCCGCTTATTGATAGC。
ITS擴(kuò)增反應(yīng)體系為：5 μL 10×PCR Buffer（50 mmol/L KCl；10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.3；1.5 mmol/L MgCl2）、2 μL DNA模板、ITS1-F和ITS4（10 μmol/L）各2.5 μL、4 μL dNTPs（2.5 mmol/L）、0.5 μL Taq DNA聚合酶（5 U/μL），加ddH2O至50 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性60 s，52 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸8 min。取5 μL ITS-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后用凝膠成像處理系統(tǒng)觀察拍照。
1.3.3 ITS-PCR產(chǎn)物的純化 采用DNA純化試劑盒，按照說明書進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化。
1.3.4 ITS-PCR產(chǎn)物的限制性酶切分析 ITS-PCR產(chǎn)物的T-RFLP分析反應(yīng)體系為30 μL：含10 μL ITS-PCR產(chǎn)物、2 μL Hinf I（10 U/μL）、3 μL 10× Buffer、加ddH2O至30 μL。置于37 ℃水浴中酶切反應(yīng)4 h，然后65 ℃作用20 min終止反應(yīng)。將酶切產(chǎn)物送至上海美吉生物醫(yī)藥有限公司測序。
1.3.5 數(shù)據(jù)分析 每個T-RFLP的豐度百分比（Ap，%）按照公式Ap=ni/N×100%計算， 其中ni代表每個可分辨的T-RFLP的峰面積， N代表所有T-RFLP峰面積的總和。種群多樣性指數(shù)[8]用BIO-DAP軟件計算。依據(jù)公式Cs=2N（A+B）/（NA+NB）計算樣品之間Sorenson[9，10]的相似系數(shù)， 其中NA+B指兩樣品共有的條帶數(shù)目，NA、NB指兩樣品各自包含的條帶數(shù)目。
2 結(jié)果與分析
2.1 不同森林類型土壤真菌T-RFLP分析結(jié)果
利用限制性內(nèi)切酶Hinf Ⅰ對6種不同森林類型土壤真菌ITS區(qū)進(jìn)行酶切，T-RFLP分析結(jié)果見圖1。從圖1可以看出，酶切譜帶清晰，RFLPs比較明顯，酶切片段在100～600 bp之間，不同森林類型真菌群落存在明顯差異。
2.2 不同森林類型土壤真菌多樣性
不同森林類型土壤真菌香農(nóng)多樣性指數(shù)、均勻度見表2。由表2可知，1號樣點的香農(nóng)多樣性指數(shù)最高，3號樣點的最低；1、2、3、5號樣點的均勻度高，4號樣點的均勻度最低。一般而言，多樣性越高群落穩(wěn)定性大，穩(wěn)定性的大小反映了多樣性的大小。植物根系可為微生物棲息提供很好的場所，植被覆蓋使得土壤濕度更適合于群落的發(fā)展，微生物群落的發(fā)展反過來又有利于植物群落的發(fā)展。
2.3 不同森林類型土壤真菌相似性
從不同森林類型土壤真菌群落結(jié)構(gòu)相似性系數(shù)分析結(jié)果見表3。由于森林類型的不同，土壤的真菌群落也有較大差異，群落功能也有較大差異，甚至森林類型接近的土壤，真菌的相似性也比較低，森林土壤真菌的空間差異性很大。
3 小結(jié)與討論
3.1 土壤樣品DNA的提取與純化
如何獲得高質(zhì)量的土壤樣品總DNA是分子生物學(xué)技術(shù)的基礎(chǔ)和關(guān)鍵[11]，只有獲得高質(zhì)量的土壤樣品總DNA才能保證后續(xù)PCR擴(kuò)增的準(zhǔn)確、可靠。土樣中主要污染物為多糖、腐殖酸和酚類化合物，其中腐殖酸的理化性質(zhì)與核酸相似，因此在DNA提取過程中很難完全去除，而腐殖酸等雜質(zhì)會影響后續(xù)的PCR反應(yīng)[12]。
3.2 土壤真菌多樣性指數(shù)
香農(nóng)多樣性指數(shù)是一種評價不同土壤的微生物群落多樣性十分有效的方法，香農(nóng)多樣性指數(shù)越高表明微生物群落多樣性越大，它由種類的豐富度及種類的均勻度兩部分組成[13，14]。在不同類型的森林土壤中，真菌的群落香農(nóng)多樣性指數(shù)呈現(xiàn)出較大的差異性和復(fù)雜性，這可能是由于天然森林中的真菌的空間異質(zhì)性高所致。白樺林中后期和過熟闊葉紅松林，光照充足， 干擾少， 土壤結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定， 枯枝落葉積累多， 水分涵養(yǎng)好， 適合微生物生長， 所以土壤真菌的類群多，土壤相對較肥沃。從整體上來看， 白樺林中后期和闊葉紅松林土壤質(zhì)量高， 微生物種類多，土壤結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，有利于植物的生長。
該研究對不同森林類型土壤真菌群落的變化規(guī)律進(jìn)行研究， 探討了真菌群落的演替規(guī)律， 但對于真菌群落的變化規(guī)律以及微生物與植物之間如何互作還需進(jìn)一步研究。同時對于其他樣點的森林類型土壤微生物群落的變化規(guī)律如何還有待進(jìn)一步揭示。
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中圖分類號：S154.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2012）23-5253-06
Advances of Total DNA Extraction Technology for Soil Microbial Diversity Research
XIAO Bin，JIANG Dai-hua，LIU Li-long，LIU Quan-dong
（College of Agronomy，Guangxi University，Nanning 530005，China）
Abstract： The influencing factors and application aspects， as well as the potentials and limitations of DNA extraction techniques for microbial diversity analysis were reviewed. Applying appropriate methods to extract microorganism DNA fragment that have right purity and appropriate size from soil were the precondition in soil microbial study on the molecular level， and the subsequent molecular biotechnology operations were all rely on these methods.
Key words： soil microorganism； diversity； DNA； extraction method
土壤微生物多樣性是生物多樣性研究的一個重要領(lǐng)域，是指其在遺傳、種類、結(jié)構(gòu)與生態(tài)功能方面的變化，對指示土壤微生物群落的穩(wěn)定性，在保持土壤質(zhì)量和生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性等方面具有重要意義[1]，是當(dāng)今國內(nèi)外關(guān)注和研究的熱點問題之一。
長期以來，由于研究方法的限制，傳統(tǒng)的分離純化培養(yǎng)技術(shù)僅能獲得土壤中微生物總種群數(shù)的1%左右，而絕大部分微生物目前還不能獲得純培養(yǎng)[2]，未能獲得純培養(yǎng)的微生物才是土壤微生物的主體，因此，有關(guān)微生物多樣性研究進(jìn)展不大。
近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和研究手段的更新，基于土壤微生物群落總DNA的現(xiàn)代微生物分子生態(tài)學(xué)研究方法避免了傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法的缺點，被廣泛應(yīng)用于土壤微生物群落結(jié)構(gòu)、功能以及動態(tài)監(jiān)測研究[3]。因此作為微生物群落分子分析方法的基礎(chǔ)，最重要的一步就是從土壤樣品中盡量毫無偏差地提取出高質(zhì)量的、具有代表性的微生物總基因組DNA。關(guān)于土壤微生物DNA提取方法的報道很多[4，5]，然而這些方法主要側(cè)重于土壤中的細(xì)菌群落，很少關(guān)注土壤中真菌群落總基因組DNA的提取方法及其提取效果。另外，細(xì)胞裂解不完全、DNA分子吸附在樣品基質(zhì)顆粒的表面、從樣品中同時提取了某些重要酶的活性抑制劑、DNA分子的損耗、降解和破壞等因素也影響著土壤微生物DNA提取的質(zhì)量，因而提取土壤微生物總DNA在研究中尤為重要[6]。本文主要對DNA提取過程中的主要影響因素、現(xiàn)行各方法的優(yōu)缺點以及存在的問題作一綜述。
1 基于DNA方法的土壤微生物多樣性研究現(xiàn)狀
傳統(tǒng)微生物學(xué)研究方法主要依賴于純培養(yǎng)技術(shù)和顯微鏡技術(shù)，對土壤微生物多樣性的描述與研究存在一定的局限性。20世紀(jì)中后期，隨著土壤微生物多樣性研究向多方面發(fā)展，人們嘗試著利用分析微生物細(xì)胞中某種指示成分，如磷脂脂肪酸（PLFA）來研究土壤微生物的種群組成，但是這些方法的缺陷是無法保證細(xì)胞中某種指示成分在土壤中的穩(wěn)定性，并且如果某種微生物的PLFA是未知的，則該不可培養(yǎng)微生物仍難以鑒別[7，8]。
1980年，Torsvik等[9]首次建立了從土壤樣品中直接提取細(xì)菌DNA的方法，并于1990年將其成功應(yīng)用于DNA雜交技術(shù)，研究發(fā)現(xiàn)1 g土壤中有4 000個以上不同的細(xì)菌種類，說明土壤中微生物多樣性是極其豐富的。后來研究者發(fā)現(xiàn)16S rDNA在原核微生物中普遍存在，并且含有相對保守和可變區(qū)域，在不同的個體間16S rDNA基因序列也不會進(jìn)行基因交換，因此，每一種生物都有自己的獨(dú)特序列。1986年，Pace[3]第一次以16S rDNA為基礎(chǔ)確定環(huán)境樣品中的微生物，使人們對大量不可培養(yǎng)微生物群體有了全新的認(rèn)識。此后，基于16S rDNA基因的指紋圖譜分析的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)得到迅速發(fā)展，包括限制性片段長度多態(tài)性分析（RFLP）、隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性分析（RAPD）、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（SSCP）、基因芯片（Microarray）、PCR-DGGE/TGGE 等，為全面揭示土壤微生物種群結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性提供了重要手段。其總的技術(shù)路線：分離微生物基因組DNA，用特異性引物擴(kuò)增16S rRNA基因片段，再將該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行更深一步分析，從而可在種、屬的水平上研究不同生境中的微生物種群結(jié)構(gòu)及其動態(tài)變化[10]。
2 土壤微生物總DNA的提取
從土壤樣品中提取DNA的方法大致可分為2類，即間接提取法和直接提取法。間接提取法首先是對土壤樣品進(jìn)行反復(fù)懸浮和離心，去除土壤等雜質(zhì)，提取土壤微生物細(xì)胞，再采用酶裂解細(xì)胞提取微生物總DNA。直接裂解法是不去除土壤等雜質(zhì)，而是通過物理的、化學(xué)的、酶解等手段相結(jié)合，直接裂解土壤中的微生物細(xì)胞，使其釋放DNA，再進(jìn)行提取和純化。但不論采用何種方法，都存在一定的缺陷，要想提取較完整的DNA需要具備以下幾個條件： ①土壤微生物能從土壤中充分釋放，尤其是那些緊緊吸附在土壤顆粒，甚至深藏于土壤微穴中的細(xì)菌等相對比較難分離的微生物。②對一些比較頑固的微生物，如革蘭氏陽性菌、孢子和小細(xì)菌的裂解，需要更劇烈的處理，而這又會造成對裂解敏感的細(xì)菌DNA折斷。③采集土壤樣品后應(yīng)盡快提取DNA，因為土壤在4 ℃儲藏幾周就會造成大分子DNA的降解。
2.1 間接提取土壤微生物總DNA
Torsvik等[11]最先報道了從土壤中提取微生物DNA的間接法，包括以下4個步驟：①分散土壤；②土壤微生物的提?。ǚ蛛x細(xì)胞與土壤）；③土壤微生物的純化；④細(xì)胞裂解及DNA純化。
2.1.1 土壤分散 土壤微生物一般與土壤顆粒結(jié)合，包藏在土壤團(tuán)聚體內(nèi)，因此，最大限度地分散土壤是從土壤中分離提取微生物的關(guān)鍵。通常采用物理或化學(xué)法，或是二者相結(jié)合以達(dá)到微生物與土粒分離的目的。常用的物理分散技術(shù)是使用玻璃珠與土壤懸液一起振蕩，或是使用韋林氏攪拌器（勻漿器、轉(zhuǎn)子混合器）攪拌分散，或是使用超聲波分散土壤團(tuán)聚體等。而化學(xué)分散法是通過加入化學(xué)分散劑以達(dá)到促進(jìn)微生物與土粒分離的目的。最常用的分散劑為0.2%焦磷酸鈉，其他還有Winogradsky鹽溶液、Tris緩沖液、生理鹽水、六偏磷酸鈉、膽酸鈉、脫氧膽酸鈉、純水等[26]。值得注意的是，為有效地分散土壤，分散劑的種類、濃度、加入量、機(jī)械作用（振蕩、攪拌和超聲波等）的方式、時間以及容器的大小等均應(yīng)加以考慮。還可以將化學(xué)試劑與機(jī)械方法結(jié)合來懸浮土壤顆粒。研究發(fā)現(xiàn)Chelex100就是一種有效的土壤顆粒懸浮劑。各種分散方法分散效果不同，采用何種分散方法效果最佳目前尚無一致結(jié)論，而且防止細(xì)胞因物理、化學(xué)作用導(dǎo)致破裂提前釋放DNA很重要，處理不當(dāng)會使DNA降解。常用分離提取土壤微生物的土壤分散方法列入表1。
2.1.2 土壤微生物的提取 土壤微生物的提取通常采用離心分離法，既要使微生物與土壤顆粒分離，又要保證基本不破壞微生物細(xì)胞。由于土壤中細(xì)菌的平均密度（1.1 μg/cm3）遠(yuǎn)小于土壤礦物質(zhì)的平均密度（2.6 μg/cm3），因此采用離心或淘選法可使細(xì)菌與土壤顆粒得到較好的分離。Hopkins等[17]采用密度逐級離心法分離出60%以上的土壤細(xì)菌。此外，也有學(xué)者提出用過濾法，即將土壤樣品分散處理后，經(jīng)20 μm或30 μm微孔篩真空抽濾，其濾液中即可能含有絕大多數(shù)土壤細(xì)菌，此過程操作簡便，提取液中土壤殘留物少，易于純化。
由于土壤中的真菌、放線菌主要以菌絲的形態(tài)與土壤顆粒纏繞在一起以及細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的特殊性，從土壤樣品中分離提取真菌放線菌要比提取單細(xì)胞的細(xì)菌相對困難。迄今為止，國內(nèi)外有關(guān)分離提取真菌的研究文獻(xiàn)極少，且這些報道方法所提取的真菌菌絲只占真菌總生物量的極少部分。Vilarino等[21]在前人研究的基礎(chǔ)上提出了分離土壤真菌的原理：新鮮土壤經(jīng)分散后，土壤懸浮液中的菌絲可附著在慢速轉(zhuǎn)動的銅絲（直徑150 μm）框上，洗脫后即得提取的土壤真菌。潘力等[22]以曲霉菌為例，采用微波處理菌絲并置于10× TE Buffer中即可得到DNA，建立了一種快速提取絲狀真菌DNA的實驗方法，為高通量快速篩選絲狀真菌轉(zhuǎn)化子奠定了基礎(chǔ)。吳敏娜等[23]以傳統(tǒng)土壤總DNA提取方法及純菌DNA提取方法為基礎(chǔ)，分別與蝸牛酶、纖維素酶進(jìn)行組合、優(yōu)化，得到7種不同的土壤真菌基因組DNA提取方法。分離提取土壤細(xì)菌和真菌的流程如圖1所示。
2.1.3 土壤微生物的純化 目前常用兩相分離技術(shù)對上述土壤微生物提取液進(jìn)行純化。兩相分離技術(shù)最早為德國化學(xué)家Albertsson于20世紀(jì)50年代所建立，當(dāng)時主要用于生物大分子的分離。近些年該技術(shù)廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和生物工程等領(lǐng)域，是一種分離、純化生物大分子、細(xì)胞、病毒的方法，該技術(shù)也逐步發(fā)展成為一種溫和的生物分離方法，相對于原始的純化手段具有過程簡單、純化時間較短等特點，應(yīng)用領(lǐng)域廣泛[24]。關(guān)于其分離機(jī)制目前尚不完全清楚，有人認(rèn)為其分離的原理主要取決于不同組分的親水性差異，也有人認(rèn)為還與不同組分的電荷性質(zhì)差異有關(guān)。當(dāng)兩種互不相溶的聚合物以一定濃度溶于水中時，便可形成體積不同的兩相，被分離組分由于其與兩相的親和力不同，分別進(jìn)入不同相從而達(dá)到分離的目的。目前應(yīng)用最為廣泛的是PEG（聚乙二醇）/Dextran（葡聚糖）系統(tǒng)和PEG/無機(jī)鹽（磷酸鹽或硫酸鹽）系統(tǒng)。對于不同的兩相組分，分離時間不盡相同[25]。Smith等[19]研究了應(yīng)用兩相分離技術(shù)從土壤中分離純化非菌絲體微生物的效果，發(fā)現(xiàn)經(jīng)充分混合靜置一定時間后，即可形成上下兩層體積比約為4∶1的兩相分離系統(tǒng)，其中細(xì)菌主要富集在上層PEG相，土壤殘存顆粒將進(jìn)入下層Dextran相，經(jīng)4次提取純化，富集在上層PEG相的細(xì)菌總量約達(dá)加入兩相分離系統(tǒng)細(xì)菌總量的60%，而上層PEG相中的土壤礦質(zhì)顆?？偭績H占總加入量的4%以下。李妍等[26]用2%PEG+6%Dextran兩相分離技術(shù)（A2PP）純化細(xì)菌，測定細(xì)菌生物量，研究兩相分離技術(shù)在土壤微生物研究領(lǐng)域的可應(yīng)用性，結(jié)果表明采用0.1%膽酸鈉、鈉型離子交換樹脂、玻璃珠與土壤一起在4 ℃下振蕩2 h，能較好地分散、純化土壤細(xì)菌。研究表明，兩相分離技術(shù)同樣有可能用于分離純化土壤真菌。
2.2 直接提取土壤微生物總DNA
現(xiàn)今的土壤細(xì)菌DNA直接提取法是在Ogram等[27]建立的方法基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，主要包括兩個步驟：①原位細(xì)胞裂解；②DNA提取和純化。
2.2.1 原位細(xì)胞裂解 直接裂解土壤微生物細(xì)胞的方法包括：機(jī)械破碎法、化學(xué)法、酶解法及3種手段相結(jié)合。機(jī)械破碎法常用的有凍融法、微波、超聲波法和玻璃微珠震蕩法；化學(xué)法常用表面活性劑SDS和SarkosyI、熱酚、高鹽、異硫氰酸胍等；酶解法：裂解酶、溶菌酶、蛋白酶K、鏈霉蛋白酶等。其中溶菌酶不僅可處理革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁，還可水解糖苷鍵和腐殖酸。2種或多種方法相結(jié)合對DNA的提取效果較好。王嘯波等[28]采用PBS緩沖液洗滌土壤樣品，結(jié)合SDS裂解微生物細(xì)胞的方法，同時提取2種土壤樣品的微生物DNA和RNA，結(jié)果表明該法提取的核酸不需要進(jìn)一步處理，其純度就可以滿足后續(xù)的分子生物學(xué)試驗，從而避免了由于純化導(dǎo)致的核酸量的降低。熊開容等[29]采用凍融+玻璃珠+溶菌酶+SDS方法提取了活性污泥中微生物DNA，結(jié)果表明獲得的DNA適合于酶解和PCR擴(kuò)增要求。
值得關(guān)注的是，土壤中微生物種類繁多，生理狀態(tài)不同，革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌以及細(xì)菌與真菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和組成亦不相同。為了使提取的DNA具有代表性，就必須保證土壤樣品中所有微生物細(xì)胞裂解釋放出核酸，因此必須根據(jù)試驗的性質(zhì)、要求選擇適當(dāng)裂解方法。研究表明，基于SDS的高鹽提取法會對一些革蘭氏陽性細(xì)菌效果不好。張瑞福等[30]采用凍融+溶菌酶+SDS方法提取3種芽孢桿菌（G+）DNA，結(jié)果表明經(jīng)凍融處理的霉?fàn)钛挎邨U菌均提取到了DNA，未經(jīng)凍融處理的霉?fàn)钛挎邨U菌未提取到DNA，且凍融處理未對DNA造成大的剪切，提取的DN段還大于23.1 kb。張穎慧等[31]使用優(yōu)化的CTAB法提取真菌基因組DNA。使用液氮凍融以及玻璃珠振蕩的方法代替了傳統(tǒng)的液氮研磨，實驗結(jié)果表明該方法所需菌體量少，且得到的基因組DNA比用傳統(tǒng)的CTAB法得到的基因組DNA產(chǎn)率高、純度好且步驟簡單，適用于一次微量提取多個樣品的基因組DNA，可用于大部分分子生物學(xué)基本實驗如PCR和DNA的酶切等。
2.2.2 DNA提取和純化 在已報道的DNA提取和純化方法中，通常采用飽和酚或氯仿和蛋白酶處理，去除DNA樣品中的蛋白質(zhì)和部分RNA，然后對DNA進(jìn)行抽提，再用乙醇、異丙醇或聚乙二醇（PEG）沉淀后，經(jīng)羥基磷灰石柱或氯化銫密度梯度超速離心等進(jìn)一步純化。其他純化方法有聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）法、色譜法、電泳法、透析和過濾法、試劑盒法等。
Lamontagne等[32]研究結(jié)果表明PVP能夠與腐殖酸結(jié)合，起到有效去除提取的DNA中腐殖酸雜質(zhì)、提高DNA純度的作用。李靖宇等[33]采用氯化鈣-SDS-酶法對濕地土壤微生物DNA進(jìn)行提取，結(jié)果表明該方法能高效去除濕地土壤腐殖酸，純度較高，能直接滿足PCR擴(kuò)增。李鈞敏等[34]用含PVPP的緩沖液預(yù)洗DNA樣品，然后添加CaCl2和牛血清白蛋白可去除其中的腐殖酸，用PEG8000沉淀DNA，可提高DNA質(zhì)量，并證實這是一種簡便有效可直接應(yīng)用于PCR分析的土壤微生物總DNA的提取方法。蔡劉體等[35]采用 SDS-CTAB法提取煙草病圃土壤微生物總DNA，該方法既可達(dá)到裂解效果，還有助于去除腐殖酸，有利于提高所提取DNA 的質(zhì)量。吳紅萍等[36]采用酚氯仿和柱式腐殖酸去除劑對粗提取的土壤微生物DNA進(jìn)行純化后，可用于PCR擴(kuò)增，并以細(xì)菌16S rDNA基因引物可擴(kuò)增到相應(yīng)的片段。朱立成等[37]采用直接法提取土壤微生物總DNA，然后用Sephadex G-200凝膠離心層析法純化，可得到純度較高的DNA。段學(xué)軍等[38]采用稀釋模板及巢式PCR法很好地解決了在DNA提取純化過程中不能完全去除腐殖質(zhì)的問題。滕應(yīng)等[39]將BIO101 Systems公司研制的FastPrep多試管核酸提取系統(tǒng)與相應(yīng)的Fast DNA SPINKit for Soil試劑盒聯(lián)用，有效地提取了重金屬復(fù)合污染的農(nóng)田土壤微生物總DNA。
沒有哪種單一的純化步驟可以除去所有污染物，故許多研究者已經(jīng)將幾種純化步驟結(jié)合起來以期獲得最好的純化效果。Smalla等[40]將粗提的DNA進(jìn)行3步純化：①氯化銫密度梯度超速離心純化；②醋酸鉀沉淀；③Geneclean純化。發(fā)現(xiàn)經(jīng)前2步純化的DNA通過稀釋即可部分被限制性酶切和擴(kuò)增，但如不經(jīng)稀釋而進(jìn)行限制酶切和擴(kuò)增，則必需進(jìn)行最后一步純化。
2.2.3 直接法和間接法的比較 研究表明，直接法獲得的DNA較多，但不易去除抑制劑，間接法提取的DNA只占直接法的1/10，但分離的DNA純度較高，而且間接法得到的細(xì)菌量只占總菌群的25%～50%，直接法提得的DNA卻可以超過細(xì)菌總DNA的60%。因此，要想獲得大量DNA，選擇直接法較好，當(dāng)所需DNA量不大，而且要排除真核或胞外DNA污染時，可用間接提取法。
直接提取對某些特定樣品用特定的操作方法能獲得較高的提取效率，但是對有些生物量不高的樣品則很難得到足夠的環(huán)境總DNA用于后續(xù)操作，適合在樣品生物量較大但采樣量不大的情況下采用。間接提取在提取效率上遠(yuǎn)小于直接提取，但用間接提取法所得到的環(huán)境總DNA純度較高，所有樣品能直接用于PCR擴(kuò)增，并且能更好地體現(xiàn)樣品中微生物的多樣性，適用于有大量樣品的情況。
2.3 DNA的純度和濃度測定
DNA在260 nm處有吸收峰，腐殖酸在230 nm處有吸收峰，計算OD230/OD260（腐殖酸/DNA）的比值可以確定所提DNA中腐殖酸的污染程度。一般情況下OD230/OD260比值應(yīng)在0.4～0.5之間為好， OD230/OD260比值越高，腐殖酸污染越嚴(yán)重。蛋白質(zhì)在280 nm處有吸收峰，因此OD260/OD280比值經(jīng)常被用來指示DNA中蛋白質(zhì)的污染程度，當(dāng)OD260/OD280比值為1.8～2.2時，DNA較純，當(dāng)受蛋白質(zhì)或其他雜質(zhì)污染時，OD260/OD280值則較低[41]。此外，還可采用PCR擴(kuò)增檢測DNA的純化質(zhì)量，所用擴(kuò)增引物見文獻(xiàn)[42]。
提取的DNA濃度也可根據(jù)測定的OD260值計算，根據(jù)公式[dsDNA]=50×OD260×稀釋倍數(shù)，計算DNA的濃度（μg/mL），換算出每克干土提取DNA的量[43]；還可采用DyNA Quant 200熒光儀對純化后DNA的濃度進(jìn)行測定[28]。
3 影響土壤微生物總DNA提取的因子
土壤成分復(fù)雜，含有大量的有機(jī)及無機(jī)等多種生物活性抑制物，如腐殖酸、多酚類化合物、重金屬等，它們的存在可能影響土壤DNA的提取質(zhì)量，抑制DNA聚合酶的活性從而影響土壤微生物多樣性的分析。研究發(fā)現(xiàn)，腐殖酸是土壤DNA提取過程中極難去除的污染物，由于它的分子大小和理化性質(zhì)與DNA相似，過分注重腐殖酸的去除，勢必會造成DNA的大量損失，因此腐殖酸的有效去除是土壤DNA提取的難點所在。
各種土壤類型、質(zhì)地和成分的差異，都會影響土壤微生物DNA的提取效果。Zhou等[44]用SDS-CTAB法從8種土壤（包括沃土、沙沃土和沙黏土，其中黏土含量為5%～31%不等）中提取DNA，平均獲得DNA的量為0.5～26.9 μg/g，并發(fā)現(xiàn)獲得的DNA量與土壤的有機(jī)磷含量有明顯的正相關(guān)關(guān)系。另外，研究也發(fā)現(xiàn)，土壤中細(xì)菌的裂解效率與其中黏粒的含量呈明顯的負(fù)相關(guān)。土壤中各粒級顆粒對細(xì)菌的吸附量從大到小的順序為：黏粒、粉粒、細(xì)沙粒、粗沙粒，其中黏粒是粉粒的3.7～4.9倍、細(xì)沙粒的44.3～89.2倍、粗沙粒的262.0～799.0倍，細(xì)菌在粒徑不同的土壤顆粒表面的最大與最小吸附量分別相差389.0和857.0倍，去有機(jī)質(zhì)土壤顆粒對細(xì)菌吸附親和力較含有機(jī)質(zhì)土壤顆粒的大[45]。因此，不同的土壤適合于不同的DNA提取方法，在土壤DNA提取過程中，應(yīng)針對土壤類別選取合適的提取方法，以便進(jìn)行后續(xù)研究。
4 小結(jié)
從土壤微生物群體基因組的角度研究其多樣性及功能是可行的方法，并受到廣泛的關(guān)注[46]。因而越過分離培養(yǎng)的步驟，直接從土壤中獲得總DNA以分析土壤微生態(tài)群落結(jié)構(gòu)，關(guān)鍵是如何盡可能全面地提取土壤中微生物的總DNA。土壤本身成分復(fù)雜，有許多物質(zhì)難以預(yù)料，對提取較好質(zhì)量的DNA提出了很高的要求。因此建立一種簡單有效的提取方法顯得非常重要。
間接法提取的微生物DNA純度較高，提取的種類和數(shù)量較少；直接提取法直接在土壤中裂解細(xì)胞，使其中內(nèi)含物盡可能地釋放，能夠代表大部分的土壤微生物，但土壤中所含物質(zhì)種類較復(fù)雜，所以提取的DNA質(zhì)量受到很大的影響，需要進(jìn)一步純化，而這些處理往往造成部分DNA的喪失，可能使在土壤中本身存在量較少的種類喪失或檢測不到，影響到土壤微生物多樣性的分析。最近，Milko等[47]發(fā)現(xiàn)一種Taq DNA聚合酶基因突變型可增加對腐殖酸等PCR抑制物的抗性，不需要對基因組DNA進(jìn)行純化就可以進(jìn)行后續(xù)的分子生物學(xué)分析，因此具有廣泛的應(yīng)用前景。
絕大多數(shù)直接提取法提取的DN段長度不會超過23 kb，而DNA的某些用途如宏基因組文庫構(gòu)建，需要大片段的DNA，直接提取法對此幾乎無能為力。
在DNA提取產(chǎn)率高即表示其所代表的微生物多樣性高的前提下，DNA直接提取法被認(rèn)為是較好的方法并被廣泛應(yīng)用[48]。但近年來有研究表明DNA提取的產(chǎn)率高不等同于微生物的多樣性高，間接提取法又再次被提出并用于相關(guān)研究[49]。這就要求在選擇提取方法時不僅要試用直接提取和間接提取這兩類方法，而且在每類方法中也要試用不同的處理組合方式，以使后續(xù)操作能順利進(jìn)行，并得到準(zhǔn)確可信的研究結(jié)果。
評價一種土壤微生物DNA提取方法是否有效，除了通常要求的提取片段無降解且比較完整外，還需要能夠有效去除土壤中大量存在的影響后續(xù)實驗的物質(zhì)，如腐殖酸、腐殖酸似物、酚類化合物、重金屬離子等；能在單位樣本量中比較徹底地提取出微生物DNA；提取方法應(yīng)具有普適性，對土壤中大多數(shù)微生物能夠有效等[50]，且提取的DNA能更好地代表土壤微生物的真實性和異質(zhì)性。
5 展望
目前，國內(nèi)外對土壤微生物總DNA提取方法的報道很多，但每一種方法都存在一定的缺陷。因此，從土壤樣品中提取DNA還沒有通用的最佳方案，需要根據(jù)具體的土壤特點、實驗室條件和實驗?zāi)康亩?。在提取過程中還要兼顧實驗操作是否簡便，方法是否經(jīng)濟(jì)以及樣品量是否充足。另外，將現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)與傳統(tǒng)微生物研究方法結(jié)合起來，才能更全面地認(rèn)識和理解土壤微生物群落多樣性及其相應(yīng)的生態(tài)功能。
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關(guān)鍵詞:污水治理;水源保護(hù);生態(tài)學(xué)分析
Key words: sewage treatment;water conservation;ecological analysis
中圖分類號:TU992文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A文章編號:1006-4311(2010)15-0170-01
0引言
水是人類社會生產(chǎn)和生活必不可少的寶貴自然資源,也是生物賴以生存的環(huán)境資源。工業(yè)革命以來,隨著科技進(jìn)步和社會生產(chǎn)力的極大提高,人類創(chuàng)造出前所未有的物質(zhì)財富,加速推進(jìn)了文明發(fā)展的進(jìn)程。與此同時,人類的生產(chǎn)生活活動產(chǎn)生的污染也造成了水環(huán)境質(zhì)量不斷惡化和水資源危機(jī)的加劇,水環(huán)境污染與水資源短缺已演變成備受全世界關(guān)注的資源環(huán)境問題,嚴(yán)重地阻礙著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人民生活質(zhì)量的提高,繼而威脅著人類的未來生存和發(fā)展。
1我國污水治理的技術(shù)環(huán)境
在污水治理設(shè)備方面,總體技術(shù)也落后于國際先進(jìn)水平,僅為國際20世紀(jì)70-80年代的水平。這些污水治理設(shè)備僅僅可以滿足一般工業(yè)廢水和生活污水的處理需求。由于處理設(shè)備單機(jī)產(chǎn)品多,系列化程度低,成套裝置生產(chǎn)不足,嚴(yán)重缺乏生產(chǎn)高新生物技術(shù)處理設(shè)備的能力。我國生產(chǎn)的用于城市污水治理的動力設(shè)備,如鼓風(fēng)機(jī)、水泵等,普遍存在能耗較大的問題,造成我國城市污水治理設(shè)施的運(yùn)營費(fèi)用居高不下,在一定程度上也制約了我國城市污水治理產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。[1]
2我國的污水治理技術(shù)
2.1 厭氧生物處理技術(shù)厭氧生物處理技術(shù)的能耗較低,可以回收生物能(如:沼氣),污泥產(chǎn)量較低。厭氧微生物可以對好氧微生物所不能降解的有機(jī)物進(jìn)行降解或部分降解;對溫度、pH等環(huán)境因素要求較高。但整體來說,經(jīng)厭氧生物處理的出水,水質(zhì)較差,需要進(jìn)一步利用好氧法進(jìn)行處理,伴隨氣味較大,對氨氮的去除效果不理想。
2.2 好氧生物處理技術(shù)常用的好氧生物處理工藝有三大類:活性污泥法、生物膜法、膜生物反應(yīng)器工藝。
①活性污泥法工藝?；钚晕勰喾ㄖ饕▊鹘y(tǒng)性污泥法污水處理技術(shù)、氧化溝技術(shù)、間歇式活性污泥處理技術(shù)(SBR,Sequencing Batch Reactor)和AB法污水處理技術(shù)。SBR法的工藝流程簡單,且造價低,主體設(shè)備只有序批式間歇反應(yīng)器,無需二沉池和污泥回流系統(tǒng),初沉池也可省略。具有布置緊湊,占地面積小的特點,可根據(jù)水質(zhì)和水量情況靈活運(yùn)行,具有良好的脫氮除磷效果。[2]②生物膜法工藝。污水的生物膜處理技術(shù)既是傳統(tǒng)的,又是發(fā)展中的污水生物處理技術(shù)。迄今為止,屬于生物膜處理法的工藝有生物濾池(普通生物濾池、高負(fù)荷生物濾池、塔式生物濾池)、生物轉(zhuǎn)盤、生物流化床、曝氣生物濾池(BAF)、生物接觸氧化、純氧生化處理等。生物濾池是早期出現(xiàn)、至今仍在研究、發(fā)展中的污水生物處理技術(shù),而后三種則是近幾十年來開發(fā)的新工藝。③膜生物反應(yīng)器工藝。膜生物反應(yīng)器MBR是二十世紀(jì)未發(fā)展起來的新技術(shù),它是膜分離技術(shù)和活性污泥生物技術(shù)的結(jié)合。它不同于活性污泥法,不使用沉淀池進(jìn)行固液分離,而是使用中空纖維膜替代沉淀池,因此具有高效固液分離性能,同時利用膜的特性,使活性污泥不隨出水流失,在生化池中形成超高濃度的活性污泥濃度,使污染物分解徹底,因此出水水質(zhì)良好、穩(wěn)定,出水細(xì)菌、懸浮物和濁度接近于零。生活污水處理后可直接回用,在污水處理方面具有傳統(tǒng)工藝所不具備的優(yōu)點。
2.3 污水的自然處理技術(shù)污水的自然生物處理方法主要是利用自然的生態(tài)系統(tǒng)如土地、濕地等,通過生態(tài)系統(tǒng)中的動物、植物與微生物協(xié)同作用,去除污水中污染物的一種方法。我國在“七五”期間就已經(jīng)對廢水土地處理技術(shù)進(jìn)行了廣泛的研究,解決了許多技術(shù)上的問題,“八五”期間又列入了國家攻關(guān)重點項目,這也為我國推廣應(yīng)用土地處理系統(tǒng)創(chuàng)造了條件。[3]
3PLFA方法分析曝氣生物濾池微生物的研究
3.1 PLFA方法在水體微生物群落結(jié)構(gòu)和生物多樣性分析中應(yīng)用在現(xiàn)有的關(guān)于水中微生物群落的研究中,PLFA一般只能定性的、粗略的區(qū)別革蘭氏陽性、陰性、好氧細(xì)菌、厭氧細(xì)菌、放線菌、真菌等,很少能用來定性的測量指定種屬的微生物。目前,只有少數(shù)幾種PLFA生物標(biāo)志物可以指示某些種屬的細(xì)菌,如硫酸鹽還原細(xì)菌等。地下水中原生動物的PLFA標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)有助于了解深層含水層中微生物食物鏈結(jié)構(gòu)和微生物的活性,在地下水的微生物修復(fù)方面具有重要意義。[4]
3.2 PLFA方法在沉積物微生物群落結(jié)構(gòu)和生物多樣性分析中應(yīng)用江、海等沉積物的微生物區(qū)是由復(fù)雜的微生物群落組成,它能夠完成主要的礦化反應(yīng),這對營養(yǎng)元素的循環(huán)和大部分深海食物鏈的形成具有重要作用。使用PLFA譜圖分析方法能夠獲得有關(guān)沉積物中微生物生物量和群落結(jié)構(gòu)的信息,沉積物樣品可以不進(jìn)行處理,也可以是冷凍或凍干的。PLFA法在沉積物微生物群落結(jié)構(gòu)和生物多樣性分析中的應(yīng)用,對污水治理技術(shù)的提高有著重要的現(xiàn)實意義。
4結(jié)語
水是人類賴以生存的三大生命要素之一。在我國,經(jīng)過幾十年的改革開放,經(jīng)濟(jì)得到了迅猛發(fā)展,同時也帶來了諸多環(huán)境問題,尤其是水污染十分突出,嚴(yán)重制約著社會經(jīng)濟(jì)和環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展。隨著我國工業(yè)、農(nóng)業(yè)的迅速發(fā)展和人們生活水平的提高,水體污染現(xiàn)象越來越嚴(yán)重,直接威脅著人類的生命健康和整個生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。嚴(yán)峻的水形勢迫切要求我們必須大力進(jìn)行污水處理及其資源化,同時由于我國經(jīng)濟(jì)水平尚不發(fā)達(dá),更迫切需要我們研究、推廣和應(yīng)用處理高效、投資節(jié)省、運(yùn)行低耗的污水處理新技術(shù)。
參考文獻(xiàn):
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記者：請您為我們介紹一下深海生態(tài)系統(tǒng)調(diào)查研究的意義與動態(tài)情況。
邵宗澤：深海水體、深海沉積物、深海平原、海山、海溝、冷泉等各種生境構(gòu)成了深海特殊的生態(tài)系統(tǒng)。深海生態(tài)系統(tǒng)是地球上最大的生態(tài)系統(tǒng)，復(fù)雜獨(dú)特、生境多樣，蘊(yùn)藏著巨大的基因資源，已引起國際社會高度關(guān)注。
與地球上其他生態(tài)系統(tǒng)相比，對深海生態(tài)系統(tǒng)的調(diào)查研究還很少。雖然早在1977年，美國“阿爾文”號深潛器就發(fā)現(xiàn)了深海熱液區(qū)，但目前對深海熱液生態(tài)系統(tǒng)的認(rèn)識還比較膚淺。不同地質(zhì)背景的熱液成分及生物群落組成具有獨(dú)特性，目前對各大洋的熱液生態(tài)系統(tǒng)的分布與生物種群特征還沒有全面的了解。對古菌、細(xì)菌以及噬菌體等在深海生態(tài)系統(tǒng)的形成與維持過程中的作用，還有很多問題等待解答，熱液活動在地球生命起源中的作用仍是一個謎。
記者：深海微生物是深海生態(tài)系統(tǒng)的重要成員，請您介紹一下國際上深海微生物調(diào)查研究的情況。
邵宗澤：微生物是深海生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分，與其他海洋生物形成了密切的共附生關(guān)系。深海極端高溫、低溫、有氧、無氧等各種各樣的環(huán)境條件選擇出了多種多樣的微生物。營養(yǎng)貧乏的大洋環(huán)境造就了寡營養(yǎng)的海洋微生物，寡營養(yǎng)微生物以其精簡的基因組和特殊的代謝機(jī)制適應(yīng)了特殊的深海環(huán)境?？偟膩碚f，各種古菌、細(xì)菌、噬菌體廣泛分布于整個海洋環(huán)境，構(gòu)成了獨(dú)特的“深部生物圈”，它們在地球生物化學(xué)循環(huán)中起著重要作用。
其中，深海化能自養(yǎng)微生物對熱液及海底冷泉生態(tài)系統(tǒng)的形成至關(guān)重要。用時8年的化能自養(yǎng)生態(tài)系統(tǒng)計劃（ChEss project）對南大西洋、南太平洋等四個海區(qū)的深?；茏责B(yǎng)生態(tài)系統(tǒng)進(jìn)行了調(diào)查。在位于南太平洋開曼海槽（Cayman trough）的超慢速擴(kuò)張洋中脊，發(fā)現(xiàn)了水深最深熱液口（6800米），生態(tài)環(huán)境獨(dú)一無二；在南大西洋中脊發(fā)現(xiàn)了最熱的熱液口，還在新西蘭附近發(fā)現(xiàn)了巨大的深海冷泉區(qū)，在北極的摩恩（Mohns Ridge）發(fā)現(xiàn)了大量的硫氧化菌席。
深海沉積物也是一個巨大的、天然的DNA資源庫，僅位于深海沉積物頂部的10厘米空間，據(jù)估算約含有4.5億噸脫氧核糖核酸（DNA）。已經(jīng)證實，海底1626米以下的沉積物中也有微生物活動。深海中蘊(yùn)藏著地球上最為豐富的物種多樣性和最大的生物量，被公認(rèn)是未來重要的基因資源來源地，具有巨大的應(yīng)用開發(fā)潛力。
隨著環(huán)境基因組、宏蛋白組等組學(xué)分析技術(shù)的進(jìn)步，對海洋微生物的認(rèn)識取得了重大進(jìn)展。美國克雷格?文特爾研究小組開展的海洋微生物環(huán)境基因組系列調(diào)查發(fā)現(xiàn)，僅在表層海水就有大量的微生物新物種、新基因、新蛋白、新途徑。這些微生物新物種、新蛋白家族、新代謝過程的科學(xué)價值、環(huán)境作用和資源價值目前難以估量。
記者：目前，深海生物基因資源已成為各國在國際海底競相角逐的戰(zhàn)略資源，能不能介紹一下國際社會的看法與態(tài)度？
邵宗澤：人類對海洋生物基因資源知識產(chǎn)權(quán)的擁有量每年在以12%的速度快速增長，目前有超過18000個天然產(chǎn)物和4900個專利與海洋生物基因有關(guān)，說明它不再只是個應(yīng)用遠(yuǎn)景，而是一類現(xiàn)實的可商業(yè)利用的重要生物資源?；蚪M測序技術(shù)與生物信息技術(shù)的發(fā)展，大大加速了海洋微生物基因資源的發(fā)現(xiàn)與發(fā)掘速度。
目前，公海海洋生物基因資源的保護(hù)與可持續(xù)利用，以及知識產(chǎn)權(quán)歸屬已經(jīng)成為聯(lián)合國國際海底會議的重要議題。從2004年起，聯(lián)合國會員大會成立了“國家管轄以外海域的海洋生物多樣性工作組”，每兩年召開正式會議磋商，我國每次由外交、管理人員和學(xué)術(shù)專家應(yīng)邀組團(tuán)參加，目前還沒有被國際社會廣泛接受的法律框架來保護(hù)和規(guī)范海洋生物基因資源的開發(fā)。
發(fā)達(dá)國家與發(fā)展中國家因各自的經(jīng)濟(jì)實力、深海調(diào)查能力的差異，對海底遺傳資源生物勘探所持的態(tài)度也不一致。發(fā)達(dá)國家堅持先入為主、自由采探，主張知識產(chǎn)權(quán)的保護(hù)。相反，發(fā)展中國家主張“人類共同遺產(chǎn)”原則，堅持利益共享，不支持公海海洋生物基因資源知識產(chǎn)權(quán)的申請保護(hù)。
記者：我國近年來在我國大洋深海生物基因資源勘探方面的研究進(jìn)展與現(xiàn)狀如何？
邵宗澤：我國在“十五”期間就啟動了深海生物及其基因資源的相關(guān)研究，并依托國家海洋局第三海洋研究所建立了中國大洋生物基因研發(fā)基地。在深海微生物研究裝備的研制、深海微生物基礎(chǔ)科學(xué)研究以及資源開發(fā)應(yīng)用方面取得了重要進(jìn)展。從2003年起，初步建立了我國第一個深海微生物資源庫。2005年起，在國家自然科技資源共享平臺的支持下，在深海微生物資源庫的基礎(chǔ)上建立了中國海洋微生物菌種保藏管理中心。經(jīng)過六年積累，分離了大量新的大洋微生物資源，并通過資源的標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化整理，建立了資源共享平臺。
“十一五”期間，在大洋協(xié)會洋中脊項目支持下，發(fā)表深海微生物研究論文200多篇，其中147篇SCI文章發(fā)表在美國科學(xué)院院刊等重要學(xué)術(shù)刊物上。在極端微生物資源獲取、極端酶研究、活性物質(zhì)篩選以及微生物多樣性分析等方面取得了重要進(jìn)展，初步形成了集大洋生物基因資源勘探及大洋科學(xué)研究于一體的優(yōu)秀團(tuán)隊。
“十二五”期間，在深海生物調(diào)查技術(shù)能力、深海（微）生物勘探與資源潛力評估以及微生物資源開發(fā)方面，已經(jīng)得到了在科技部、海洋局、大洋協(xié)會等各 類項目大力支持，有望獲得更大的進(jìn)展。
2.1990-2010年中國土地利用變化對生物多樣性保護(hù)重點區(qū)域的擾動
3.青藏高原高寒草甸植物群落生物量對氮、磷添加的響應(yīng)
4.新疆連作棉田施用生物炭對土壤養(yǎng)分及微生物群落多樣性的影響
5.荒漠草地4種灌木生物量分配特征
6.旱地土壤施用生物炭減少土壤氮損失及提高氮素利用率
7.生物肥部分替代化肥對花椰菜產(chǎn)量、品質(zhì)、光合特性及肥料利用率的影響
8.不同秸稈生物炭對紅壤性水稻土養(yǎng)分及微生物群落結(jié)構(gòu)的影響
9.生物炭對土壤生境及植物生長影響的研究進(jìn)展
10.沙質(zhì)草地不同生活史植物的生物量分配對氮素和水分添加的響應(yīng)
11.大興安嶺5種典型林型森林生物碳儲量
12.水稻秸稈生物炭對耕地土壤有機(jī)碳及其CO_2釋放的影響
13.土壤重金屬鈍化修復(fù)劑生物炭對鎘的吸附特性研究
14.生物炭對不同土壤化學(xué)性質(zhì)、小麥和糜子產(chǎn)量的影響
15.生物炭施用對礦區(qū)污染農(nóng)田土壤上油菜生長和重金屬富集的影響
16.準(zhǔn)噶爾荒漠6種類短命植物生物量分配與異速生長關(guān)系
17.生物炭對土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)及其生物地球化學(xué)功能的影響
18.生物炭對水中五氯酚的吸附性能研究
19.生物炭和有機(jī)肥處理對平邑甜茶根系和土壤微生物群落功能多樣性的影響
20.生物炭對旱作農(nóng)田土壤理化性質(zhì)及作物產(chǎn)量的影響
21.中國南方3種主要人工林生物量和生產(chǎn)力的動態(tài)變化
22.南海北部邊緣盆地生物氣/亞生物氣資源與天然氣水合物成礦成藏
23.基于多源遙感數(shù)據(jù)的草地生物量估算方法
24.生物炭對農(nóng)田土壤微生物生態(tài)的影響研究進(jìn)展
25.生物炭對土壤理化性質(zhì)影響的研究進(jìn)展
26.生物擾動對沉積物中污染物環(huán)境行為的影響研究進(jìn)展
27.生物炭與秸稈添加對砂姜黑土團(tuán)聚體組成和有機(jī)碳分布的影響
28.近十年中國生物入侵研究進(jìn)展
29.荒漠灌木生物量多尺度估測——以梭梭為例
30.土壤有機(jī)污染物生物修復(fù)技術(shù)研究進(jìn)展
31.生物醫(yī)學(xué)大數(shù)據(jù)的現(xiàn)狀與展望
32.黑河中游荒漠草地地上和地下生物量的分配格局
33.生物大滅絕研究三十年
34.不同熱解溫度生物炭對Cd(Ⅱ)的吸附特性
35.農(nóng)用生物炭研究進(jìn)展與前景
36.生物炭對水稻根系形態(tài)與生理特性及產(chǎn)量的影響
37.施用生物炭對旱作農(nóng)田土壤有機(jī)碳、氮及其組分的影響
38.不同生物質(zhì)來源和熱解溫度條件下制備的生物炭對菲的吸附行為
39.城市生物多樣性分布格局研究進(jìn)展
40.生物炭的土壤環(huán)境效應(yīng)及其機(jī)制研究
41.遼河源不同齡組油松天然次生林生物量及空間分配特征
42.稻殼基生物炭對生菜Cd吸收及土壤養(yǎng)分的影響
43.小興安嶺7種典型林型林分生物量碳密度與固碳能力
44.東北林區(qū)4個天然針葉樹種單木生物量模型誤差結(jié)構(gòu)及可加性模型
45.指數(shù)施肥對楸樹無性系生物量分配和根系形態(tài)的影響
46.牛糞生物炭對水中氨氮的吸附特性
47.黃土丘陵區(qū)生物結(jié)皮對土壤物理屬性的影響
48.半干旱沙地生境變化對植物地上生物量及其碳、氮儲量的影響
49.青藏高原東緣野生暗紫貝母生物量分配格局對高山生態(tài)環(huán)境的適應(yīng)
50.長江口及東海春季底棲硅藻、原生動物和小型底棲生物的生態(tài)特點
51.全球生物多樣性評估方法及研究進(jìn)展
52.中國生物多樣性就地保護(hù)的研究與實踐
53.溫度與降水協(xié)同作用對短花針茅生物量及其分配的影響
54.環(huán)境質(zhì)量評價中的生物指示與生物監(jiān)測
55.土壤生物多樣性研究:歷史、現(xiàn)狀與挑戰(zhàn)
56.轉(zhuǎn)錄因子對木質(zhì)素生物合成調(diào)控的研究進(jìn)展
57.太赫茲科學(xué)技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用研究
58.玉米秸稈生物炭對Cd2+的吸附特性及影響因素
59.中國糧食作物秸稈焚燒排碳量及轉(zhuǎn)化生物炭固碳量的估算
60.生物炭對我國南方紅壤和黃棕壤理化性質(zhì)的影響
61.黑龍江省大興安嶺森林生物量空間格局及其影響因素
62.不同生物質(zhì)原料水熱生物炭特性的研究
63.鳳眼蓮、稻草和污泥制備生物炭的特性表征與環(huán)境影響解析
64.東北地區(qū)兩個主要樹種地上生物量通用方程構(gòu)建
65.不同來源生物炭對砷在土壤中吸附與解吸的影響
66.生物炭生產(chǎn)與農(nóng)用的意義及國內(nèi)外動態(tài)
67.秸稈生物反應(yīng)堆與菌肥對溫室番茄土壤微環(huán)境的影響
68.生物炭對土壤肥料的作用及未來研究
69.玉米秸稈生物炭對土壤無機(jī)氮素淋失風(fēng)險的影響研究
70.黃土丘陵區(qū)生物結(jié)皮對土壤可蝕性的影響
71.內(nèi)蒙古草甸草原與典型草原地下生物量與生產(chǎn)力季節(jié)動態(tài)及其碳庫潛力
72.生物炭添加對黃土高原典型土壤田間持水量的影響
73.生物炭對黃土區(qū)土壤水分入滲、蒸發(fā)及硝態(tài)氮淋溶的影響
74.生物炭及其復(fù)合材料的制備與應(yīng)用研究進(jìn)展
75.生物炭及炭基硝酸銨肥料對土壤化學(xué)性質(zhì)及作物產(chǎn)量的影響
76.臭冷杉生物量分配格局及異速生長模型
77.施用生物炭后塿土土壤微生物及酶活性變化特征
78.寧夏荒漠草原不同群落生物多樣性與生物量關(guān)系及影響因子分析
79.中國生物多樣性調(diào)查與保護(hù)研究進(jìn)展
80.三種小球藻生物柴油品質(zhì)指標(biāo)評價
81.AM真菌對重金屬污染土壤生物修復(fù)的應(yīng)用與機(jī)理
82.含度量誤差的黑龍江省主要樹種生物量相容性模型
83.生物炭與農(nóng)業(yè)環(huán)境研究回顧與展望
84.氮磷添加對巨桉幼苗生物量分配和C:N:P化學(xué)計量特征的影響
85.生物炭對土壤肥力與環(huán)境質(zhì)量的影響機(jī)制與風(fēng)險解析
86.東北林區(qū)天然白樺相容性生物量模型
87.氮肥與生物炭施用對稻麥輪作系統(tǒng)甲烷和氧化亞氮排放的影響
88.黃土高原丘陵區(qū)生物結(jié)皮土壤的斥水性
89.檢測食品沙門氏菌的生物傳感器持久性研究
90.生物炭對砂壤土節(jié)水保肥及番茄產(chǎn)量的影響研究
91.土壤碳收支對秸稈與秸稈生物炭還田的響應(yīng)及其機(jī)制
92.抑制煙草青枯病型生物有機(jī)肥的田間防效研究
93.生物炭對塿土土壤含水量、有機(jī)碳及速效養(yǎng)分含量的影響
94.生物炭對寧夏引黃灌區(qū)水稻產(chǎn)量及氮素利用率的影響
95.茶葉生物化學(xué)研究進(jìn)展
96.鄂爾多斯盆地西緣奧陶紀(jì)生物礁基本特征、分布規(guī)律及成礁模式
97.中國履行《生物多樣性公約》二十年:行動、進(jìn)展與展望
98.不同時期施用生物炭對稻田N_2O和CH_4排放的影響
99.生物炭對設(shè)施連作黃瓜根域基質(zhì)酶活性和微生物的調(diào)節(jié)
100.生物有機(jī)肥對連作蕉園香蕉生產(chǎn)和土壤可培養(yǎng)微生物區(qū)系的影響
101.柴達(dá)木盆地幾種荒漠灌叢植被的生物量分配格局
102.牛糞生物炭對磷的吸附特性及其影響因素研究
103.紅樹林植物生物量研究進(jìn)展
104.農(nóng)業(yè)活動及轉(zhuǎn)基因作物對農(nóng)田生物多樣性的影響
105.煤矸石場植被自然恢復(fù)初期草本植物生物量研究
106.鐵改性生物炭對磷的吸附及磷形態(tài)的變化特征
107.青藏高原草地地下生物量與環(huán)境因子的關(guān)系
108.蔬菜種植農(nóng)戶施用生物農(nóng)藥意愿研究
109 生物炭對夏玉米生長和產(chǎn)量的影響
110.不同生物炭添加量下植煙土壤養(yǎng)分的淋失
111.生物DNA條形碼:十年發(fā)展歷程、研究尺度和功能
112.生物炭和生物炭基氮肥的理化特征及其作物肥效評價
113.木質(zhì)素與生物燃料生產(chǎn):降低含量或解除束縛?
114.生物炭添加對半干旱地區(qū)土壤溫室氣體排放的影響
115.磷回收對厭氧/好氧交替式生物濾池蓄磷/除磷的影響
116.天山林區(qū)六種灌木生物量的建模及其器官分配的適應(yīng)性
117.非模式生物轉(zhuǎn)錄組研究
118.添加生物炭對灌淤土土壤養(yǎng)分含量和氮素淋失的影響
119.生物炭和腐植酸類對豬糞堆肥重金屬的鈍化效果
120.間伐對川西亞高山粗枝云杉人工林細(xì)根生物量及碳儲量的影響
121.生物多樣性信息學(xué)研究進(jìn)展
122.長白落葉松林齡序列上的生物量及碳儲量分配規(guī)律
123.不同燒制溫度下玉米秸稈生物炭的性質(zhì)及對萘的吸附性能
124.利用農(nóng)業(yè)生物多樣性持續(xù)控制有害生物
125.騰格里沙漠東南緣4種灌木的生物量預(yù)測模型
126.生物炭碳封存技術(shù)研究進(jìn)展
127.豬糞制備的生物炭對西維因的吸附與催化水解作用
128.生物炭修復(fù)土壤重金屬污染的研究進(jìn)展
129.古爾班通古特沙漠4種荒漠草本植物不同生長期的生物量分配與葉片化學(xué)計量特征
130.生物炭覆蓋對底泥污染物釋放的影響
1.DGGE技術(shù)的原理
變性梯度凝膠電泳（DGGE）是根據(jù)小片段DNA分子（1kb以下）的熔解溫度不同來分析DNA分子的多樣性，理論上可以檢測到單個堿基替換的DNA分子。DN段在丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于自身的物理性狀，熔解狀態(tài)的DNA分子片段在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移速度比雙鏈DNA分子慢[4]。當(dāng)DN段處在變性劑濃度不斷增加的凝膠系統(tǒng)中，隨著電泳的遷移就會部分融化，達(dá)到一定變性劑濃度時DNA就會熔解為單鏈的分子，這些離散的碎片集中在一個比較狹窄的變形梯度范圍內(nèi)，這樣不同的DNA分子在不同變性劑濃度下熔解，在整個電泳圖譜中成樓梯式排列。通過對比熔解狀態(tài)下DN段的多態(tài)性，就可以推測有堿基突變或序列差異的DNA分子片段。
為了提高檢出率可在DNA一端加入一個高熔點區(qū)―GC夾（GC clamp）；GC夾就是在一側(cè)引物的5′端加上一個30～40bp的連續(xù)GC堿基，這樣在PCR產(chǎn)物的一側(cè)可產(chǎn)生一個GC夾的高熔點區(qū)，從而使相應(yīng)的部分序列處于低熔點區(qū)而便于檢測分析；這樣，DGGE的突變檢出率可提高到接近于100%[4]。
2.DGGE技術(shù)在微生物生態(tài)學(xué)中的應(yīng)用
自然界中85%～99.9%的微生物是不可純培養(yǎng)的[5]，并且微生物的形態(tài)具有難觀測性和可變性，在傳統(tǒng)的實驗方法下不能提供足夠的微生物學(xué)信息，這嚴(yán)重阻礙了對自然環(huán)境中微生物構(gòu)成及特征的客觀認(rèn)識。PCR-DGGE 技術(shù)在微生物生態(tài)學(xué)中的一個最主要的應(yīng)用就是分析微生物群落構(gòu)成，Muyzer 等人于1993年首次將DGGE技術(shù)應(yīng)用于微生物膜系統(tǒng)和生物菌苔的群落多樣性分析。此后，該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于各種微生物生態(tài)系統(tǒng)的檢測，絕大部分研究都是通過擴(kuò)增原核生物 16S rDNA 基因來研究各生態(tài)系統(tǒng)中的古細(xì)菌或細(xì)菌的群落多樣性[6]，或者用真菌的通用引物擴(kuò)增18SrDNA 基因，從而研究真菌的群落多樣性，另外除了通過rDNA基因來分析微生物群落結(jié)構(gòu)組成外，還可以通過擴(kuò)增功能性基因來研究功能基因及功能菌群的差異。
Lam等利用DGGE技術(shù)對真菌18SrDNA的序列進(jìn)行分析，研究Magnolia liliifera葉片中真菌的多樣性，結(jié)果在葉片的不同部位得到通過培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)研究未能得到的14株不同菌株[7]。Eeva等對挪威紅杉?xì)堉颖局苯舆M(jìn)行DNA提取，利用DGGE分析通過FR1和NS1引物對擴(kuò)增的1650 bp rDN段，結(jié)果得到了46株木材腐爛真菌，為真菌群體中難培養(yǎng)的菌株的檢測提供了新的方法[8]。Zhou等對藏靈菇發(fā)酵液里的真菌和細(xì)菌的DNA進(jìn)行提取后，擴(kuò)增細(xì)菌16SrRNA和真菌28SrRNA上的相應(yīng)片段，之后用DGGE進(jìn)行分析得到11株優(yōu)勢菌株，并且在不同樣本之間細(xì)菌存在78～84%的相似度，酵母存在80-92%的相似度[9]。
PCR-DGGE 技術(shù)在微生物生態(tài)學(xué)中的另一個重要應(yīng)用是檢測微生物的動態(tài)變化。宋亞娜等運(yùn)用16SrDNA和18S rDNA特異性引物對，將土壤中提取的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，通過DGGE技術(shù)對PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析，研究不同間作和輪作種植體系對作物根際真菌和細(xì)菌菌落結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果表明，間作明顯改變玉米的根際細(xì)菌、真菌的菌落結(jié)構(gòu)[10]。Takada利用PCR-DGGE研究化學(xué)熏蒸后對散土和菠菜根部土壤中真菌群落的變化，結(jié)果表明，三氯硝基甲熏蒸兩個月后，在散土和菠菜根部土壤中真菌的多樣性都減少，并且一年后真菌的多樣性并沒有完全恢復(fù)到原來的水平，但是菠菜根部土壤中真菌減少量比散土中要少，1，3-二氯丙烯處理兩個月后，真菌的多樣性只發(fā)生微小的改變，并且六個月后就與對照組沒有顯著差異了[11]。
PCR-DGGE技術(shù)還可用于發(fā)現(xiàn)新的微生物菌株。Santegoeds等通過DGGE分析細(xì)菌16SrRNA上的基因片段來檢測多次富集培養(yǎng)的菌藻系，得到了14條獨(dú)特的16SrRNA基因序列，其中有10個細(xì)菌株的基因是以前利用純培養(yǎng)手段及單純的分子技術(shù)方法均沒有發(fā)現(xiàn)的[12]。
3.DGGE技術(shù)的局限性及改進(jìn)方法
DGGE 技術(shù)作為一種分子生物學(xué)手段在研究微生物群落的動態(tài)行為和復(fù)雜性方面發(fā)揮著重要的作用，是目前被普遍接受的的分子生物學(xué)工具，但是作為一種分子水平上的技術(shù)，除了具有多數(shù)分子技術(shù)所固有的缺點之外（如PCR產(chǎn)物偏差等），本身也有一定的應(yīng)用局限性。
首先，利用DGGE分離的PCR產(chǎn)物一般要求DNA長度在200～ 700bp范圍內(nèi)[1]，超出該范圍DGGE的分辨率會下降，然而這些序列只能提供有限的系統(tǒng)發(fā)育信息，不利于判斷微生物所屬的系統(tǒng)類群。其次，DGGE通常顯示的是微生物群落中的優(yōu)勢種群，Muyzer研究發(fā)現(xiàn)該技術(shù)只能對菌體數(shù)量大于總菌量1%的菌群進(jìn)行分析[1]。再次，每種菌可能含有數(shù)目不等的rRNA基因[13]，則可能會導(dǎo)致群落中菌株數(shù)量被過多的估計從而夸大群落差異性和多態(tài)性。另外，如果選用的條件不是特別適宜就不能保證將每類DN段完全分開，這樣序列不同的DN段遷移到凝膠的同一位置，導(dǎo)致同一條帶中含有不同種類的細(xì)菌[14]。
對于DGGE存在的這些缺限我們可以通過各種手段加以改善，例如可以優(yōu)化電泳及PCR的條件從而減少誤差，并且在進(jìn)行DGGE之前通過軟件來分析檢測PCR過程中形成的嵌合體，另外，可以與其他技術(shù)方法相結(jié)合，如純培養(yǎng)、直接形態(tài)觀察、原位雜交、核酸探針檢測技術(shù)等，這樣不僅更客觀的從多方面反映環(huán)境中微生物的多樣性信息，還可以與其他方法相互補(bǔ)充，從而不斷提高分子微生物生態(tài)學(xué)的研究水平。DGGE技術(shù)與傳統(tǒng)方法或其它分子生物技術(shù)的結(jié)合進(jìn)一步促進(jìn)了人們對微生物生態(tài)的認(rèn)識；隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，DGGE技術(shù)將會得到不斷的補(bǔ)充和完善，必將在微生物生態(tài)研究中發(fā)揮更大的作用。
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中圖分類號：Q93-335 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）10-2295-04
嗜堿菌是一類最適生長于pH大于或等于9的環(huán)境中的微生物，根據(jù)它們在pH 7 條件下生長與否可分為專性嗜堿菌和兼性嗜堿菌兩大類[1，2]。對于嗜堿菌新菌株的分離、堿性蛋白酶的基因克隆和應(yīng)用、極端環(huán)境適應(yīng)機(jī)制、結(jié)構(gòu)新穎的活性產(chǎn)物的分離都是當(dāng)今極端環(huán)境微生物研究的熱點[3-6]。嗜堿菌已廣泛應(yīng)用于發(fā)酵工業(yè)、石油化工、農(nóng)作物生長改良和環(huán)境污染物的生物修復(fù)等多個領(lǐng)域[7，8]。目前，對嗜堿菌的嗜堿機(jī)理研究又有了新的重要突破[9]。
內(nèi)蒙古有廣闊的鹽堿湖分布，蘊(yùn)藏著豐富的微生物資源，其中嗜堿微生物呈現(xiàn)較高的生物多樣性[10，11]。嗜堿菌有很高的經(jīng)濟(jì)價值和生產(chǎn)應(yīng)用潛力，對其進(jìn)行深入研究和開發(fā)利用，將成為我國戰(zhàn)略生物資源的平臺之一，有利于發(fā)揮生物技術(shù)創(chuàng)新的支撐作用。因此，對分離于渾善達(dá)克鹽堿湖的一株嗜堿菌的基本特征進(jìn)行了分析，以期為進(jìn)一步認(rèn)識和開發(fā)內(nèi)蒙古地區(qū)的極端環(huán)境微生物資源奠定基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 鹽堿湖桿菌菌株 鹽堿湖桿菌菌株MIM18由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院應(yīng)用與環(huán)境微生物研究所從內(nèi)蒙古渾善達(dá)克鹽堿湖中分離獲得。
1.1.2 培養(yǎng)基
1）液體培養(yǎng)基。酵母粉2 g/L，蛋白胨2 g/L，K2HPO4 0.2 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，NaCl 10 g/L，微量元素1 mL/L，微生素 100 μL/L，pH 9～10。
2）固體培養(yǎng)基。在液體培養(yǎng)基中加入瓊脂15 g/L制成。
3）半固體培養(yǎng)基。在液體培養(yǎng)基中加入瓊脂4 g/L制成。
4）微量元素溶液配方（g/L）。FeCl3 0.05，MnSO4·H2O 0.02，H3BO3 0.01， CuSO4·5H2O 0.01，（NH4）6Mo7O24 ·4H2O 0.02，ZnSO4 0.01 g，EDTA 0.5，CaCl2·2H2O 0.2。
5）微生素溶液配方（g/L）。生物素 0.02，VB1 0.02，VB12 0.001，硫辛酸 0.05。
1.2 方法
1.2.1 形態(tài)特征和生長曲線的繪制 通過革蘭氏染色和平皿劃線培養(yǎng)的方法來觀察MIM18的基本形態(tài)特征。將MIM18菌種接種于含100 mL液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，置33 ℃、200 r/min水浴搖床光照培養(yǎng)。隔時取樣于600 nm處測定吸光度。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制生長曲線。
1.2.2 耐鹽試驗 調(diào)整培養(yǎng)基中鹽濃度分別為0、10、20、30、40、50、55、60 g/L。固體培養(yǎng)基平皿劃線光照培養(yǎng)測定MIM18的耐鹽程度；液體培養(yǎng)基（裝液量為100 mL/（250 mL），接種量2%）33 ℃、200 r/min水浴搖床培養(yǎng)3 d后于600 nm處測定吸光度，每個梯度3個平行[12，13]。
1.2.3 pH對生長的影響 調(diào)整培養(yǎng)基的pH分別為5.0、5.5、6.0、7.0、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、11.0、11.5、12.0，培養(yǎng)測定方法同1.2.2。
1.2.4 溫度對生長的影響 采用含NaCl的培養(yǎng)基，分別置于0、24、27、30、33、36、40、42 ℃的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)測定方法同1.2.2。
1.2.5 氧氣對生長的影響 半固體培養(yǎng)基穿刺培養(yǎng)，每12 h觀察一次。觀察菌體的生長情況及位置。液體靜置和搖床培養(yǎng)，觀察菌體在液體中的分布。
1.2.6 光照對產(chǎn)色素的影響 劃線接種固體培養(yǎng)皿3個，兩個平皿用錫箔紙包住避光培養(yǎng)，24 h后將錫箔紙中的一個平皿光照培養(yǎng)，另一個仍避光培養(yǎng)，第三個平皿一直光照培養(yǎng)。
1.2.7 產(chǎn)酶種類和抗生素敏感性分析 產(chǎn)酶種類測定參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[14]和文獻(xiàn)[15]中的方法進(jìn)行?？股孛舾行栽囼灢捎盟幟艏埰瑱z測法[16]進(jìn)行。
2 結(jié)果與分析
2.1 MIM18的生長曲線
通過7 d的恒溫?fù)u床培養(yǎng)和吸光度測定，繪制出MIM18的生長曲線（圖1）。從圖1可以清晰看到0～12 h為延滯期，12～72 h為指數(shù)生長期，72～120 h為穩(wěn)定期，120 h后進(jìn)入衰亡期。
2.2 鹽濃度對MIM18生長的影響
經(jīng)過培養(yǎng)，MIM18可在鹽濃度0～55 g/L范圍內(nèi)生長。對比各鹽濃度的生長狀況發(fā)現(xiàn)，在鹽濃度0～40 g/L時均能較好地生長。鹽濃度為0 g/L時，菌落的顏色明顯淡于鹽濃度10～40 g/L時的菌落顏色（圖2、圖3）。鹽濃度為50 g/L時，有少數(shù)菌落生長，鹽濃度為55 g/L時只有5個左右的小菌落，鹽濃度≥60 g/L時幾乎不生長。說明低鹽有利于MIM18的生長，過高的鹽濃度將會抑制其生長。通過不同鹽濃度培養(yǎng)后測定吸光度比較發(fā)現(xiàn)（圖4），MIM18在鹽濃度0～10 g/L范圍內(nèi)隨著鹽濃度升高有利于MIM18的生長，在鹽濃度為10 g/L時生長情況最好；在鹽濃度10～40 g/L時抑制MIM18的生長，但抑制效果不明顯，當(dāng)鹽濃度為40 g/L以上時MIM18的生長明顯受到抑制。
2.3 pH對MIM18生長的影響
經(jīng)平板培養(yǎng)可知，MIM18適應(yīng)pH變化能力較強(qiáng)，能在pH 6.0～11.0環(huán)境下生長。當(dāng)pH≤5.5或≥11.5時該菌株不生長。當(dāng)pH 6.0、7.0和11.0時該菌株生長比較緩慢；pH 8.5～10.0時MIM18生長隨pH的增大逐漸加快，pH 9.5時最適生長，生長最快，也最先達(dá)到穩(wěn)定期，之后生長量隨pH增大而減小（圖5）。
2.4 溫度對MIM18生長的影響
經(jīng)平板培養(yǎng)可知，MIM18的生長溫度范圍為24～40 ℃，大于40 ℃時不再生長。從圖6可以看出，33～36 ℃為MIM18生長的適宜溫度范圍。
2.5 氧氣對MIM18生長的影響
半固體培養(yǎng)基穿刺光照培養(yǎng)24 h后，穿刺孔上部有生長跡象，之后半固體斜面生長跡象加強(qiáng)，穿刺孔中生長跡象逐漸減弱直至消失；液體培養(yǎng)時，只在液面處生長，說明氧氣是MIM18生長的必要條件，MIM18不具有運(yùn)動性。搖床振蕩培養(yǎng)與靜置培養(yǎng)對比結(jié)果表明搖床培養(yǎng)條件下MIM18的生長狀況明顯優(yōu)于靜置培養(yǎng)，說明搖床培養(yǎng)提供的氧氣對MIM18生長有重要作用。
2.6 光照對MIM18產(chǎn)色素的影響
如圖7所示，3種光照處理方式下MIM18生長狀況、菌落形態(tài)基本一致，說明光照對MIM18的色素合成乃至生長無影響。
2.7 MIM18的產(chǎn)酶種類和抗生素敏感性
經(jīng)測定，該菌株在生長中產(chǎn)生接觸酶（過氧化氫酶）、精氨酸雙水解酶、賴氨酸脫羧酶，不產(chǎn)生脲酶、苯丙氨酸脫氨酶、酯酶；甲基紅和硫化氫試驗為陽性；它對常見的抗生素（青霉素-G、紅霉素、氯霉素、四環(huán)素、慶大霉素、氨芐青霉素、羧芐青霉素、羅紅霉素、多粘菌素、卡那霉素、妥布霉素、利福平、桿菌肽）均表現(xiàn)為高度敏感。
3 結(jié)論與討論
MIM18在鹽濃度0～40 g/L范圍內(nèi)都能較好生長，適應(yīng)能力較強(qiáng)，甚至在無鹽條件下也能生長，在鹽濃度10 g/L時就能達(dá)到最適鹽濃度，說明其生長對鹽量要求不大，當(dāng)鹽濃度超過40 g/L時生長明顯受到了抑制，因此MIM18不是嗜鹽菌[10]；MIM18不僅能在強(qiáng)堿條件下生長而且能在pH 7下生長，因此是兼性嗜堿菌[11]。另外，MIM18在溫度方面要求也不十分嚴(yán)格，30～36 ℃生長差異不是很大。MIM18對pH和周圍環(huán)境的氧氣量變化很敏感，氧氣是其生長的必要條件，光照對其色素合成乃至生長沒有影響。
嗜堿菌是鹽堿湖中數(shù)量大、分布廣的極端微生物。由于其獨(dú)特的環(huán)境適應(yīng)模式，特殊的生理機(jī)制，獨(dú)特的基因類型，并有多種代謝產(chǎn)物可以利用，因而不僅成為了生命科學(xué)理論研究的理想材料，而且成為一類具有很大開發(fā)潛力的生物資源[17]。近年來，嗜堿微生物的研究發(fā)展迅速，已應(yīng)用于諸如清潔劑生產(chǎn)[18]、生物表面活性劑[19]、農(nóng)作物生長促進(jìn)劑[20]和天然產(chǎn)物的生物轉(zhuǎn)化、環(huán)境污染物降解[8，21，22]等多個方面。對鹽堿湖菌的深入研究，不僅可以開發(fā)新的微生物基因資源，而且將大大促進(jìn)微生物在人類健康、環(huán)境保護(hù)和生物技術(shù)等領(lǐng)域的利用。
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中圖分類號 S451 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-5739（2016）20-0084-03
Effects of Lantana camara Invasion on Soil Physical-chemical Properties in Rhizosphere and Non-rhizosphere Zone
KANG Xiao-wu DAI Ting-ting
（Institute of Tropical and Subtropical Ecology，South China Agricultural University，Guangzhou Guangdong 510642）
Abstract The effects of L.camara invasion on rhizosphere and non-rhizosphere soil nutrients，soil enzyme activities，microbial biomass with microbial functional diversity were studied by quadrat experiment in the field.The experimental results showed that the invasion of L.camara significantly improved the content of soil organic matter，total nitrogen，total potassium，nitrogen，available phosphorus，potassium and microbial biomass carbon，nitrogen，phosphorus.At the same time，the invasion significantly improved the activity of soil urease，protease，sucrosemetabolic，cellulase，catalase and the metabolic activity，carbon source utilization and diversity index of soil microbial community.The promoting effect was higher on the rhizospheric soil than on the non-rhizospheric soil （bulk soil）.
Key words bioinvasion；Lantana camara；rhizosphere soil ；soil physical-chemical properties
馬纓丹（Lantana camara）為馬鞭草科（Verbenaceae）馬纓丹屬（Lantana）多年生常綠灌木，原產(chǎn)于熱帶美洲，現(xiàn)廣泛分布于熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)，是世界上危害最嚴(yán)重的100種有害外來入侵物種之一[1]。馬纓丹作為一種外來入侵植物，植株繁殖能力強(qiáng)，蔓延迅速，能夠在短時間內(nèi)大面積侵占森林、果園、牧場和農(nóng)耕地，破壞當(dāng)?shù)氐纳锒鄻有院妥匀簧鷳B(tài)系統(tǒng)，并因其植株有毒而嚴(yán)重威脅到人畜健康和農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)[2-3]。1645 年馬纓丹作為一種觀賞花卉引入我國，現(xiàn)已在廣東、廣西、海南、云南等地大量蔓延擴(kuò)散，對當(dāng)?shù)氐纳锒鄻有?、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)安全造成嚴(yán)重威脅[4-5]。
有研究表明，一年蓬（Erigeron annual Fleabane）、加拿大蓬（Erigeron canadensis）、加拿大一枝黃花（Solidago canad-ensis）等植物入侵后對根際土壤理化性質(zhì)產(chǎn)生了不同程度的影響[5-6]；外來入侵植物紫莖澤蘭（Eupatorium adenopho-rum）、黃頂菊（Flaveria bidentis）等可以不同程度地提高入侵地土壤的全磷養(yǎng)分和速效養(yǎng)分[7-8]。目前，國內(nèi)外學(xué)者在馬纓丹的生物學(xué)特性、分布危害、防治以及開發(fā)利用等方面開展了大量的工作，但對馬纓丹植株的化感作用及其入侵對土壤微生態(tài)特性的影響研究較少[9-15]。筆者通過野外樣方試驗，研究了馬纓丹入侵對根際、非根際的土壤養(yǎng)分、土壤酶活性、土壤微生物生物量與土壤微生物功能多樣性的影響效應(yīng)，旨在從化感作用、土壤反饋作用的角度探索馬纓丹的入侵機(jī)制及入侵效應(yīng)，從而為更好地管理、控制馬纓丹的入侵危害提供科學(xué)依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 試驗材料
馬纓丹單優(yōu)群落的根際土壤與非根際土壤均采自于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)增城教學(xué)基地。
1.2 試驗方法
在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)增城教學(xué)科研基地，選取馬纓丹單優(yōu)群落（馬纓丹植株覆蓋率80%～90%，群落高度150～250 cm，入侵年限大于6年）內(nèi)的健壯植株，用鋤頭挖取植株地下根系（0～20 cm），抖去根系上的大塊土壤，然后用細(xì)毛刷刷取根系表層黏貼的土壤，去除雜質(zhì)后作為根際土壤，而拌落后的大塊土壤作為非根際土壤；同時選取距離馬纓丹群落50 m以外，且周圍都沒有馬纓丹植株生長的荒坡草地的表層土壤（0～10 cm）作為對照（CK）。每個處理3次重復(fù)，每次重復(fù)之間相隔200 m以上。將采集的土壤裝袋運(yùn)回實驗室，其中一部分土樣置于室內(nèi)自然風(fēng)干，除去動植物殘體，研磨過100目篩，用于土壤養(yǎng)分含量、土壤酶活性的測定分析；另一部分樣品暫時冷藏于-18 ℃冰箱，用于測定土壤微生物生物量碳、氮、磷。
1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法
所有試驗數(shù)據(jù)均在Microsoft Excel上完成處理，通過SPSS 13.0進(jìn)行方差分析（one way ANOVA），并采用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。
2 結(jié)果與分析
2.1 馬纓丹入侵對根際、非根際土壤全量、速效養(yǎng)分的影響
2.1.1 土壤全量養(yǎng)分。土壤有機(jī)質(zhì)、全氮（TN）和全鉀（TK）含量在各處理中的變化規(guī)律一致，即根際土壤的含量最高，非根際土壤次之，CK的含量最小，各處理的差異顯著（表1）。其中與 CK相比，根際土壤的有機(jī)質(zhì)、TN和TK含量分別增加40.77%、38.13%、30.16%；而與非根際土壤相比，則分別增加23.24%、14.97%和13.11%。對于土壤TP含量，根際土壤分別比CK、非根際土壤增加65.22%、58.33%，差異顯著；而非根際土壤的TP含量雖略高于CK，但差異不顯著。說明馬纓丹入侵能顯著提高自身根際的土壤有機(jī)質(zhì)、TN、TP和TK含量，同時也顯著提高非根際的土壤有機(jī)質(zhì)、TN和TK的含量，但相對而言，其對根際土壤養(yǎng)分的提升效果更加明顯。
2.1.2 土壤速效養(yǎng)分。在3個處理中，馬纓丹根際土壤的堿解氮含量最高，并且顯著高于非根際土壤和CK，而非根際土壤的堿解氮含量雖然略高于CK，但兩者的差異不顯著（表2）。對于土壤的速效磷、速效鉀含量，均表現(xiàn)為根際土壤的含量最高，非根際土壤的含量次之，CK的含量最低，各處理間的差異顯著。其中與CK相比，根際、非根際土壤的堿解氮含量分別增加32.67%和0.75%，速效磷含量分別增加87.14%和48.87%，速效鉀含量分別增加115.70%和62.72%，可見馬纓丹入侵能顯著提高土壤堿解氮、速效磷和速效鉀含量，尤其是對根際土壤的養(yǎng)分提升作用更強(qiáng)。
2.2 馬纓丹入侵對根際、非根際土壤酶活性的影響
與CK相比，馬纓丹入侵顯著提高了土壤脲酶、蛋白酶活性，其中根際土壤的脲酶、蛋白酶活性分別比CK提高104.06%和74.34%，非根際土壤的脲酶、蛋白酶活性也分別比CK增加45.53%和46.90%。可見，馬纓丹入侵對根際土壤脲酶、蛋白酶活性的促進(jìn)效果更強(qiáng)。土壤蔗糖酶、纖維素酶的活性變化也呈現(xiàn)類似的規(guī)律，即在3個處理中均表現(xiàn)為根際、非根際土壤的酶活性顯著高于CK，且根際土壤的酶活性亦顯著高于非根際土壤（表3）。其中根際、非根際土壤的蔗糖酶活性分別是CK的227.56%和157.11%，纖維素酶活性分別是CK的264.39%和161.73%?？梢?，馬纓丹入侵能顯著提高根際、非根際土壤中蔗糖酶和纖維素酶的活性，加強(qiáng)對土壤中有機(jī)碳的利用，并且這種增強(qiáng)效應(yīng)在根際土壤的表現(xiàn)更為顯著。另外，馬纓丹入侵亦能顯著提高自身根際、非根際土壤的過氧化氫酶活性，與CK相比，其增幅分別達(dá)到45.95%和27.03%
2.3 馬纓丹入侵對根際、非根際土壤微生物生物量的影響
土壤微生物生物量碳、氮、磷含量在各個處理中的變化規(guī)律一致，均表現(xiàn)為根際、非根際土壤含量顯著高于CK，同時根際土壤含量亦顯著高于非根際土壤（表4）。其中與CK相比，根際土壤微生物生物量碳、氮、磷的含量分別提高238.76%、53.55%、243.61%，非根際土壤微生物生物量碳、氮、磷含量也分別提高130.31%、14.34%、124.15%。可見，馬纓丹入侵對根際土壤微生物生物量碳、氮、磷含量的提升效應(yīng)更強(qiáng)。
2.4 馬纓丹入侵對根際、非根際土壤微生物群落功能多樣性的影響
2.4.1 土壤微生物群落代謝活性。平均孔顏色變化率（average well color development，AWCD）反映土壤微生物利用碳源的整體能力與代謝活性，也是評價利用單一碳源能力的重要指標(biāo)，可作為微生物整體活性的有效指標(biāo)。AWCD 值的變化（斜率）和最終能達(dá)到的值反映了土壤微生物利用某一碳源物質(zhì)的能力。由圖1可知，各處理中土壤微生物的AWCD值均隨著培育時間的延長不斷上升，變化趨勢一致。在最初的24 h內(nèi)AWCD變化較小，24～72 h急劇上升，然后持續(xù)緩慢升高。培養(yǎng)期間CK土壤微生物群落的AWCD值均處于較低水平，根際土壤微生物群落的AWCD值則處于最高水平，各處理的AWCD在整個培育周期內(nèi)均表現(xiàn)為根際土壤>非根際土壤>CK，其中根際土壤在培養(yǎng)24 h后一直到培養(yǎng)結(jié)束，其微生物群落的AWCD值均顯著高于CK，亦顯著高于非根際土壤；而非根際土壤在0～72 h內(nèi)的AWCD值與CK差異不顯著，72 h后與CK差異顯著。這說明馬纓
丹入侵后明顯提高了土壤微生物群落的代謝活性，并且對根際土壤的影響效應(yīng)更明顯。
2.4.2 土壤微生物群落碳源利用率。在6類碳源中，馬纓丹非根際土壤微生物群落對氨基類、酚類碳源的利用率與CK的差異不顯著，但對其他碳源的利用率則顯著高于CK（表5）。而根際土壤微生物群落對6類碳源的利用率均顯著高于CK，亦顯著高于非根際土壤，其中根際土壤微生物群落對碳水化合物類、羧酸類、聚合物類、氨基酸類、酚類和胺類碳源的利用率分別比CK增加96.91%、83.70%、82.43%、41.13%、55.74%和110.45%?？梢?，馬纓丹入侵顯著提高了土壤微生物群落對6種碳源的利用率，尤其對根際土壤的改善作用更強(qiáng)。
2.4.3 土壤微生物群落碳源利用的多樣性。與CK相比，馬纓丹入侵顯著提高了根際土壤微生物群落的Shannon-Wiener指數(shù)H′、Mc Intosh指數(shù)U、豐富度指數(shù)S和Simpson優(yōu)勢度指數(shù)Ds，而非根際土壤微生物群落的Mc Intosh指數(shù)U、豐富度指數(shù)S也顯著上升。對于Pielou均勻度指數(shù)E，各處理的差異均不明顯。說明馬纓丹入侵能夠促進(jìn)土壤微生物群落功能多樣性的提高，尤其對根際土壤的影響更強(qiáng)。
3 結(jié)論與討論
植物對土壤養(yǎng)分的吸收利用與土壤對植物生長發(fā)育過程中的反饋作用是物種競爭取勝的重要驅(qū)動機(jī)制之一[16]。大多數(shù)研究指出，外來植物入侵能夠加快土壤營養(yǎng)循環(huán)過程，提高土壤肥力，有利于促進(jìn)自身的進(jìn)一步入侵?jǐn)U散。外來植物皺果莧入侵后，土壤中碳、氮、磷的濃度顯著上升，其中入侵區(qū)的全磷、可溶性磷幾乎分別提高3倍和2倍[17]。土壤酶主要來源于土壤微生物的代謝過程和土壤中植物、動物的活體分泌或殘體分解，能夠參與土壤生態(tài)系統(tǒng)許多重要的生物化學(xué)過程和物質(zhì)循環(huán)，通過催化土壤中的生化反應(yīng)發(fā)揮重要作用，能夠客觀地反映土壤肥力狀況與系統(tǒng)功能[18-21]。土壤微生物生物量是土壤中最活躍的肥力因子之一，參與土壤有機(jī)質(zhì)分解、腐殖質(zhì)形成和土壤養(yǎng)分的循環(huán)轉(zhuǎn)化過程，能夠反映土壤同化與礦化能力的高低，是土壤生態(tài)系統(tǒng)肥力的重要生物學(xué)指標(biāo)[22]。在外來植物與本地植物的關(guān)系中，土壤微生物群落可能起到了橋梁作用，外來植物通過改變土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)組成、區(qū)系數(shù)量與生理功能，破壞土著植物與土壤微生物在長期演化過程所形成的平衡共生關(guān)系，影響土著種的資源獲取、生長繁殖與種群更新，從而使自身在競爭中獲得更大優(yōu)勢，成功入侵[23-25]。
本研究結(jié)果表明，馬纓丹入侵后，根際、非根際土壤的有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷和全鉀均顯著上升，并且馬纓丹入侵對根際土壤養(yǎng)分的提升效果更為顯著，根際土壤的有機(jī)質(zhì)、全氮、全鉀含量均顯著高于非根際土壤。同時，馬纓丹入侵亦能顯著提高土壤的速效養(yǎng)分，馬纓丹根際、非根際土壤中的堿解氮、速效磷和速效鉀均顯著高于對照；并且馬纓丹根際土壤的速效養(yǎng)分亦顯著高于非根際土壤?？梢姡R纓丹入侵顯著提高了土壤不同肥力特征，且對根際土壤肥力的提高作用更強(qiáng)，而根際土壤的養(yǎng)分更有利于根系的吸收利用，這可能是馬纓丹能夠入侵成功和快速擴(kuò)張蔓延的生態(tài)機(jī)制之一。馬纓丹的入侵顯著提高了土壤脲酶、蛋白酶、蔗糖酶、纖維素酶和過氧化氫酶的活性，且根際土壤酶的活性均顯著高于非根際土壤。這說明馬纓丹的入侵有利于土壤營養(yǎng)物質(zhì)的循環(huán)轉(zhuǎn)化過程。入侵區(qū)土壤酶活性較高，這將有利于活化土壤養(yǎng)分，提高其有效性，進(jìn)而促進(jìn)自身的入侵蔓延。馬纓丹入侵能夠顯著提高土壤微生物生物量碳、氮、磷的含量，且根際土壤的微生物生物量碳、氮、磷含量顯著高于非根際土壤。馬纓丹入侵后能顯著提高土壤微生物群落的代謝活性、碳源利用率和多樣性指數(shù)，并且其對根際土壤的影響效應(yīng)顯著高于非根際土壤。說明馬纓丹入侵后能通過提高自身生境土壤的微生物群落代謝活性從而促進(jìn)土壤養(yǎng)分循環(huán)與轉(zhuǎn)化，這也許是馬纓丹成功入侵?jǐn)U散的原因之一。本文僅研究探討了馬纓丹入侵對土壤養(yǎng)分、土壤微生物生物量、土壤微生物功能多樣性的影響效應(yīng)，而關(guān)于土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的變化及其反饋作用，可進(jìn)一步闡明馬纓丹成功入侵以及對本地植物生長影響的土壤生態(tài)學(xué)機(jī)理，今后可加強(qiáng)該方面的研究。
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