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篇1

2011-06-09收稿；2011-09-04接受

本文系寧夏自然科學(xué)基金（No. NZ1147）資助項(xiàng)目

* E-mail: gaozn@nxu.省略

1 引 言

延胡索酸泰妙菌素（Tiamulin fumarate, TF）是一種半發(fā)酵半合成雙萜類新型動(dòng)物專用抗生素（結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1），它通過(guò)抑制微生物核糖體內(nèi)感受性細(xì)菌蛋白的合成，達(dá)到抗菌作用[1]。關(guān)于延胡

圖1 泰妙菌素的結(jié)構(gòu)式

Fig．1 Structure of tiamulin

索酸泰妙菌素的研究已報(bào)道的有反相高效液相色譜法（RP-HPLC）[2]、高效液相色譜法（HPLC）[3]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS）[4]、液相色譜-二極管陣列紫外光譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-DAD-ESI-MS）[5]和電化學(xué)方法[6,7]。而在電化學(xué)方法中主要集中在碳糊電極[6]和修飾碳糊電極[7]上的電化學(xué)研究，但TF在乙炔黑-離子液體復(fù)合修飾玻碳電極上的電化學(xué)行為、電化學(xué)動(dòng)力學(xué)及電化學(xué)分析方法研究工作尚未見(jiàn)報(bào)道。

乙炔黑具有良好的電子傳導(dǎo)性、較大比表面積和較強(qiáng)吸附能力等特性[8]，故被用于化學(xué)修飾電極修飾劑[9]。室溫離子液體（RTIL）是指室溫及鄰近室溫下完全由陰、陽(yáng)離子組成的液體物質(zhì)[10]，具有電位窗口寬，生物相容性好和離子導(dǎo)電性高，能促進(jìn)電子傳遞等特點(diǎn)[11]，因此引起了電化學(xué)工作者的極大興趣。

本實(shí)驗(yàn)在前期工作[6,7,12～14]基礎(chǔ)上，將1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽 （[BMIM]PF6） 與AB混合, 制備了乙炔黑-離子液體復(fù)合修飾玻碳電極（AB-ILs/GCE），研究了TF在AB-ILs/GCE上的電化學(xué)行為及電化學(xué)動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，并建立了TF含量的電化學(xué)定量測(cè)定方法。2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

CHI660A電化學(xué)工作站（美國(guó)CHI儀器公司）；電化學(xué)測(cè)定采用三電極系統(tǒng)：以CHI104 GCE （美國(guó)CHI儀器公司）和AB-ILs/GCE為工作電極，飽和甘汞電極（SCE）為參比電極，CHI115鉑絲為輔助電極。

圖2 不同電極的電化學(xué)阻抗譜圖

Fig．2 Electrochemical impedance spectrum of acetylene black-ion liquid modified glassy carbon electrode （AB-ILs/GCE） （a）, AB/GCE（b） and GCE（c） in a mixture of 1.0 mmol/L K3Fe（CN）6-1.0 mmol/L K4Fe（CN）6 solution. Supporting electrolyte: 0.10 mol/L KCl. The frequency range is 0.1～105Hz.

TF原料藥（寧夏多維泰瑞制藥有限公司，批號(hào)：201005041）；TF注射液（贛州百靈動(dòng)物藥業(yè)有限公司，批號(hào)：080402）；1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽（[BMIM]PF6，純度99%， 上海成捷化學(xué)有限公司）；實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水。

電化學(xué)測(cè)試前于電解池中通入高純氮除氧5 min。本研究所涉及到的電位均為相對(duì)于SCE的電極電位，所有電化學(xué)測(cè)試均在室溫下進(jìn)行。

2.2 AB-ILs/GCE制備及電化學(xué)阻抗譜表征

GCE先用0.3

SymbolmA@ m α-Al2O3 拋光至鏡面，用水沖洗干凈。再分別在丙酮和水中超聲清洗2 min， 以除去殘留氧化鋁粉，晾干備用。準(zhǔn)確稱取8 mg AB并用微量取樣器移取15

SymbolmA@ L [BMIM]PF6，將二者在研缽中混合研磨約20 min，得到糊狀物，取少許糊狀物均勻涂敷在已處理好的電極表面， 制得AB-ILs/GCE。電化學(xué)阻抗譜可表征電極表面修飾過(guò)程中電阻變化信息[15]。以1.0 mmol/L Fe（CN）63

Symbolm@@ /4

Symbolm@@ 為電化學(xué)探針對(duì)GCE （圖2c），AB/GCE（圖2b）和AB-ILs/GCE（圖2a）進(jìn)行了電化學(xué)阻抗譜測(cè)試。由圖2a可知，AB-ILs/GCE在高頻區(qū)出現(xiàn)半圓?。ò雸A弧直徑代表電荷轉(zhuǎn)移電阻），且其電荷轉(zhuǎn)移電阻明顯小于AB/GCE和GCE的電荷轉(zhuǎn)移電阻，表明AB-ILs/GCE上有著較高導(dǎo)電性及較小的電荷轉(zhuǎn)移電阻；而在低頻區(qū)AB-ILs/GCE的直線斜率遠(yuǎn)大于AB/GCE和GCE的直線斜率，說(shuō)明在AB-ILs/GCE上電活性物質(zhì)從溶液擴(kuò)散到電極表面的電阻減小，擴(kuò)散速率加快[16]。

3 結(jié)果與討論

3.1 TF伏安行為

在0.10 mol/L NaH2PO4-Na2HPO4 （PBS, pH 6.8），掃描速度50 mV/s及電位窗口0.0～1.2 V的條件下，采用CV研究了1.0

SymbolmA@ mol/L TF在GCE（圖3c），AB/GCE（圖3b） 圖3 TF的循環(huán)伏安圖

Fig．3 Cyclic voltammograms of 1.0×10

Symbolm@@ 6mol/L tiamulin fumarate （TF） at GCE （c）, AB/GCE（b） and AB-ILs/GCE （a） in 0.10 mol/L PBS. Scan rate: 50 mV/s及AB-ILs/GCE（圖3a）上的伏安行為。如圖3c所示，TF在GCE上于0.74 V 處出現(xiàn)一個(gè)不可逆氧化峰，氧化峰電流為2.847

SymbolmA@ A；TF在AB/GCE上亦于0.74 V處出現(xiàn)一個(gè)不可逆氧化峰，氧化峰電流為4.386

SymbolmA@ A。與GCE相比，TF在AB/GCE的氧化峰電位基本不變，氧化峰電流增大約1.8倍；比較曲線a和曲線b發(fā)現(xiàn)，TF在AB-ILs/GCE的氧化峰電位略有負(fù)移，氧化峰電流增大約3倍。此結(jié)果表明，TF電催化氧化反應(yīng)是一個(gè)不可逆電極反應(yīng)過(guò)程，且AB-ILs/GCE對(duì)TF電催化氧化具有良好的催化作用。這可能是由于乙炔黑具有較大的比表面積，為T(mén)F的電催化氧化提供了較多的反應(yīng)位點(diǎn)，加速了TF電子交換速率[8]；另外，離子液體的高離子導(dǎo)電性也能夠進(jìn)一步促進(jìn)電子傳遞[11]。兩者的協(xié)同作用使AB-ILs/GCE對(duì)TF的電化學(xué)氧化具有更好的催化作用。在10～400 mV/s范圍內(nèi)，采用CV研究了掃描速度對(duì)TF在AB-ILs/GCE上伏安行為影響。實(shí)驗(yàn)表明，隨掃描速度增加, TF在AB-ILs/GCE氧化峰電位Epa發(fā)生正移，峰電流Ipa增大，且峰電流Ipa與掃描速度平方根（v1/2）呈良好線性關(guān)系，擬合方程為Ipa（

SymbolmA@ A）＝

Symbolm@@ 1.378＋2.778v1/2，R＝0.9962。該結(jié)果表明，TF在AB-ILs/GCE上電化學(xué)氧化是受擴(kuò)散步驟控制的電極反應(yīng)過(guò)程。

3.2 實(shí)驗(yàn)條件的影響

在電位窗口0.0～1.2 V，50 mV/s掃描速度下，分別以0.10 mol/L的KCl，Na2SO4，NaClO4，Na2HPO4-NaH2PO4（PBS, pH 6.8），NaAc-HAc，B-R （Britton-Robinson） 等為支持電解質(zhì)，對(duì)5.0×10

Symbolm@@ 5 mol/L TF進(jìn)行CV測(cè)試。實(shí)驗(yàn)表明，在PBS中TF具有良好電化學(xué)行為，因此選用PBS為支持電解質(zhì)。

在pH 2.0～9.5 范圍內(nèi)考察了介質(zhì)pH對(duì)TF伏安行為的影響。實(shí)驗(yàn)表明，在pH 2.0～8.0范圍內(nèi)Epa隨pH值增大而負(fù)移，其線性方程為Epa＝

Symbolm@@ 1124.60

Symbolm@@ 55.67（mV/pH），R＝0.9985。依據(jù)Ep（mV）＝E.0

Symbolm@@ （59m/n）/pH 得到m/n≈1；已知n＝2[7]，由此計(jì)算得到質(zhì)子參與數(shù)m＝2，即TF在AB-ILs/GCE上電化學(xué)氧化過(guò)程是2個(gè)電子2個(gè)質(zhì)子參與的不可逆電化學(xué)氧化過(guò)程；在pH 8.0～9.5范圍內(nèi)， Epa隨pH值增加而基本不變。而在pH 2.0～6.0范圍內(nèi)， 氧化峰電流Ipa隨pH值增加而降低； 在pH 6.0～9.5范圍內(nèi)， Ipa基本不變。

3.3 電化學(xué)動(dòng)力學(xué)

3.3.1 電荷轉(zhuǎn)移系數(shù)α 根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以Epa對(duì)logv作圖，得到GCE及AB-ILs/GCE上Epa-logv關(guān)系，其線性方程分別為Epa （mV）＝63.62 logv＋635.4 （R＝0.9986），Epa （mV）＝149.0 logv＋551.3，（R＝0.9987）。斜率分別為63.62和149.0 mV。

根據(jù)完全不可逆擴(kuò)散控制過(guò)程方程式[17]：

Ep＝（blogv）/2＋C（1）

式中， C為常數(shù)， b為T(mén)afel斜率，b＝2.3RTn（1

Symbolm@@ α）F。 由Epa-logv關(guān)系直線斜率可得b/2，即：b＝2

SymbolvB@ Ep

SymbolvB@ （logv） ， 已知n＝2[7]，因此計(jì)算得到α分別為0.77和0.90。

3.3.2 電極反應(yīng)速率常數(shù)kf

平板電極上可逆電化學(xué)反應(yīng)的電流響應(yīng)遵循如下關(guān)系式[18]:

I（t）＝nFAkfC（1

Symbolm@@ 2Ht/π）（2）

H＝kfD1/2Ox＋kbD1/2Rd（3）

對(duì)于完全不可逆電極反應(yīng)，kb＝0，H＝kf/D1/2Ox，采用CA可以測(cè)得電極反應(yīng)速率常數(shù)kf。由實(shí)驗(yàn)測(cè)得TF在GCE及AB-ILs/GCE上的I（t）-t1/2關(guān)系曲線 圖4 穩(wěn)態(tài)電流-時(shí)間曲線

Fig．4 Time-dependent steady state currents obtained at AB-ILs/GCE while increasing TF concentration at 0.80 V with a stirring rate of 100 r/min截距分別為5.85×10

Symbolm@@ 4 及 3.21×10

Symbolm@@ 4，計(jì)算得到TF在GCE及AB-ILs/GCE上的電極反應(yīng)速率常數(shù)kf分別為8.87×10

Symbolm@@ 2和1.23×10

Symbolm@@ 1s

Symbolm@@ 1。

在相同實(shí)驗(yàn)條件下，利用穩(wěn)態(tài)電流-時(shí)間響應(yīng)曲線方法測(cè)定了TF在AB-ILs/GCE上的響應(yīng)電流與濃度關(guān)系（圖4），TF電流響應(yīng)信號(hào)隨其濃度成比例增長(zhǎng)，響應(yīng)時(shí)間小于5 s。最低響應(yīng)濃度為0.2

SymbolmA@ mol/L。本方法檢出限低，靈敏度高，可作為T(mén)F電化學(xué)定量測(cè)定方法。

3.4 電分析方法的應(yīng)用

3.4.1 TF方波伏安行為 在電位窗口0.0～1.2 V及優(yōu)化了的方波實(shí)驗(yàn)條件 （優(yōu)化方波實(shí)驗(yàn)條件：振

圖5 TF方波伏安圖

Fig．5 Square wave voltammogram （SWV） of 1.0

SymbolmA@ mol/L TF at the at GCE （c）, AB/GCE （b） and AB-ILs/GCE （a） in 0.10 mol/L PBS

幅45 mV，方波頻率5 Hz，電勢(shì)增量6 mV） 下對(duì)1.0

SymbolmA@ mol/L TF進(jìn)行SWV測(cè)試，得到TF 在GCE，AB/GCE及AB-ILs/GCE上的SWV曲線（圖5）。TF在GCE上于0.70 V處出現(xiàn)一個(gè)不可逆氧化峰（圖5c），TF在AB/GCE上亦于0.70 V處出現(xiàn)一個(gè)不可逆氧化峰（圖5b）。與GCE相比，TF在AB/GCE氧化峰電位不變，氧化峰電流增大約2倍。比較圖5a與圖5b發(fā)現(xiàn)， TF在AB-ILs/GCE上氧化峰電位與AB/GCE上氧化峰電位相比略有負(fù)移，氧化峰電流增大2.1倍。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果與循環(huán)伏安法所得結(jié)果基本一致，進(jìn)一步表明AB-ILs/GCE對(duì)TF電化學(xué)氧化具有良好的催化作用。

3.4.2 電極重現(xiàn)性和穩(wěn)定性 同一支AB-ILs/GCE電極于5.0×10

Symbolm@@ 5 mol/L TF溶液CV掃描10次，其氧化峰電流RSD為1.9%；平行修飾6次RSD為2.9%，表明制作的修飾電極有良好的重現(xiàn)性。電極在室溫下放置48 h對(duì)， TF響應(yīng)電流的變化量在±5%以內(nèi)，表明該電極具有較好穩(wěn)定性，電極壽命為30 d。

3.4.3 干擾實(shí)驗(yàn) 在相同實(shí)驗(yàn)條件下，TF濃度為5.0×10

Symbolm@@ 5 mol/L， 考察了常見(jiàn)離子和葡萄糖、蔗糖對(duì)TF催化氧化峰電流影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，1000倍無(wú)機(jī)離子K.＋，Na.＋，SO2

Symbolm@@ 4，Cl.

Symbolm@@ ，NO.

Symbolm@@ 3和50倍酒石酸、檸檬酸、葡萄糖、蔗糖對(duì)TF電流響應(yīng)信號(hào)無(wú)干擾。

3.4.4 線性范圍及檢出限 在相同實(shí)驗(yàn)條件下用SWV研究了TF氧化峰電流Ipa隨其濃度變化關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TF氧化峰電流Ipa與其濃度在0.8～20

SymbolmA@ mol/L范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，線性方程為Ipa（

SymbolmA@ A）＝0.74＋0.23C（

SymbolmA@ mol/L）， R＝0.9973；檢出限（S/N＝3）為7.6×10

Symbolm@@ 8 mol/L。

3.4.5 實(shí)際樣品測(cè)定 取市售延胡索酸泰妙菌素注射液5支，混勻，取適量該溶液置于100 mL容量瓶，用水定容。運(yùn)用SWV方法對(duì)此溶液進(jìn)行測(cè)定，加入已知量TF標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行回收率測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 TF注射液中TF含量及回收率測(cè)定結(jié)果（n＝6）

Table 1 Determination results of TF in injection samples（n＝6）

樣品

Samples標(biāo)示量

Labeled測(cè)得值

Found（mg）RSD（%）加入量Added（mg）測(cè)得值Found（mg）回收率Recovery（%）

1230.125 mg/支（ampoule）0.1252.20.0630.189101.8

0.1271.10.0750.20198.6

0.1272.90.0880.21599.7

由表1可知，所測(cè)得TF樣品的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.1%～2.9%，加標(biāo)回收率在98.6%～101.8%之間，表明本方法精密度和準(zhǔn)確度符合定量測(cè)定要求。 結(jié)果表明，TF電催化氧化是受擴(kuò)散步驟控制的電極反應(yīng)過(guò)程，且AB-ILs/GCE對(duì)TF的電催化氧化具有良好的電催化作用。同時(shí)測(cè)定了電極過(guò)程動(dòng)力學(xué)參數(shù)，據(jù)此建立了TF電化學(xué)定量測(cè)定方法。

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Electrochemical Behaviors and Electrochemical Determination of

Tiamulin Fumarate at Acetylene Black-Ionic Liquid

Modified Glassy Carbon Electrode

CHEN Ji-Wen.1, DUAN Cheng-Qian1,2, GAO Zuo-Ning1,CHEN De-Gang.3

.1（Key Lab of Energy Source and Chemical Engineering, College of Chemistry and Chemical Engineering,

Ningxia University, Yinchuan 750021， China）

.2（Higher Vocational College, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004， China）

.3（Duowei Tairui Pharmacy Limited Company, Yinchuan 750004， China）

篇2

Effect of Aminopeptidase Inhibitor on Differentiation Induction Activity of All-trans Retinoic Acid in Human Acute Promyelocytic Leukemia NB4 Cells and Its Mechanism

Abstract

This study was purposed to investigate whether aminopeptidase inhibitor，bestatin，can potentiate all-trans retinoic acid (ATRA)-inducing differentiation in NB4 cells，and to explore its mechanism. The NB4 cells were exposed to either bestatin and ATRA alone or in combination，the morphological changes of NB4 cells were observed by optical microscopy，the CD11b expression was measured by flow cytometry，the function of defferentiation cells was analyzed by nitroblue-tetrazolium (NBT) reduction assay，the mRNA expressions of c-myc and c-EBPε in NB4 cells were detected by RT-PCR，the c-Myc protein expression was determined by Western blot. The results showed that treatment with bestatin alone induced no significant changes in morphology，NBT reduction activity and CD11b expression in NB4 cells. NB4 cells incubated with 10 nmol/L ATRA plus 100 μg/ml bestatin showed more morphologic feature of metamyelocyte and band neutrophil than ATRA alone treated cells. 100 μg/ml bestatin enhanced the NBT reduction activity in NB4 cells induced by various concentrations of ATRA (10，20，40 nmol/L). The effects of various concentrations of ATRA in combination with 100μg/ml bestatin were statistically different from the effect of ATRA alone (P

Key words bestatin; ATRA; cell line，NB4; differentiation

氨肽酶抑制劑烏苯美司（bestatin）能抑制氨肽酶N/CD13和亮氨酸氨基肽酶活性，通過(guò)增強(qiáng)宿主免疫功能及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等發(fā)揮抗腫瘤作用［1，2］。有研究提示，bestatin能夠誘導(dǎo)U937細(xì)胞的分化［1］，國(guó)內(nèi)未見(jiàn)報(bào)道。我們以NB4細(xì)胞為研究對(duì)象，通過(guò)形態(tài)、功能和表面分化抗原等多層次實(shí)驗(yàn)研究，了解bestatin是否能誘導(dǎo)NB4細(xì)胞分化及（或）對(duì)ATRA的誘導(dǎo)分化作用的增強(qiáng)效應(yīng)，并初步探討其可能的機(jī)理。

材料和方法

主要試劑

Bestatin、ATRA均購(gòu)于Sigma公司。bestatin以無(wú)菌去離子水溶解為1 mg/ml，分裝之后-20℃保存；ATRA以無(wú)水乙醇溶解成10-5 mol/L的儲(chǔ)存液，4℃避光保存，使用時(shí)用RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液將其稀釋為相應(yīng)工作濃度。NBT為BBI公司產(chǎn)品，以PBS配成0.1%溶液，過(guò)濾除菌后4℃避光保存，使用前1周內(nèi)配制。RPMI 1640為Gibco公司產(chǎn)品。胎牛血清為JRH公司產(chǎn)品。CD11b-FITC標(biāo)記單克隆抗體為T(mén)eotech公司產(chǎn)品。CD13-PE標(biāo)記單克隆抗體為Becton Dickinson公司產(chǎn)品。TRIzoL試劑為Gibco公司產(chǎn)品，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和Taq DNA合成酶為Promega公司產(chǎn)品。鼠抗人c-Myc單克隆抗體（c-33）及羊抗人β-Actin多克隆抗體（I-19）均為Santa Cruz公司產(chǎn)品，使用時(shí)以TBST液分別按1∶500和1∶1 000稀釋。ECL顯色液為Santa Cruz公司產(chǎn)品。

細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理

人APL細(xì)胞株NB4細(xì)胞（浙江大學(xué)腫瘤研究所惠贈(zèng)）及人髓細(xì)胞白血病細(xì)胞株HL-60細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液中，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2-3天傳代1次。實(shí)驗(yàn)時(shí)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為7×104/ml，以不同濃度ATRA和bestatin單獨(dú)或聯(lián)合處理，于不同時(shí)間收集細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

取空白對(duì)照組及藥物處理各組細(xì)胞懸液，離心，制備涂片，瑞氏-姬姆薩染色，用光學(xué)顯微鏡（Leica，40×10）觀察細(xì)胞形態(tài)。

四氮唑藍(lán)（nitroblue-tetrazolium，NBT）還原實(shí)驗(yàn)

按文獻(xiàn)［3］報(bào)道的方法進(jìn)行?？瞻讓?duì)照組及藥物處理各組細(xì)胞與NBT共孵育后，制備涂片，瑞氏-姬姆薩染色，光學(xué)顯微鏡下（100×10）觀察，胞漿內(nèi)含有藍(lán)黑色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞，隨機(jī)計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分率。

細(xì)胞表面分化抗原CD11b和CD13的檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HL-60細(xì)胞和NB4細(xì)胞或藥物處理后各組NB4細(xì)胞離心，用PBS（pH 7.4）洗滌，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2×105/50 μl，加CD13-PE標(biāo)記單克隆抗體8 μl或CD11b-FITC標(biāo)記單克隆抗體5 μl，避光孵育30分鐘，用PBS洗滌，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。以Cellquest 1.2軟件進(jìn)行分析。

細(xì)胞總RNA提取和RT-PCR反應(yīng)

總RNA提取 用TRIzoL一步法抽提細(xì)胞總RNA，按試劑說(shuō)明書(shū)操作。甲醛變性凝膠電泳證實(shí)為完整RNA，紫外分光光度儀定量，A260 nm/280 nm比值均在1.8-2.0之間。

逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

樣品總RNA 4 μg及隨機(jī)引物0.5 μg，70℃ 5分鐘，立即冰浴，離心。依次加5×逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液5 μl、10 mmol/L dNTP 1.25 μl、M-MLV 200 U，RNase抑制劑0.6 μl，DEPC水補(bǔ)至反應(yīng)體積為25 μl，于27℃10分鐘，37℃ 60分鐘，72℃ 10分鐘滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，冰浴1分鐘，結(jié)束反應(yīng)。

PCR反應(yīng)

PCR引物為上海Sangon公司合成。引物序列、反應(yīng)條件及產(chǎn)物大小見(jiàn)表1。反應(yīng)體系包括逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μl、10×PCR緩沖液2.5 μl、25 mmol/L MgCl2 1.5 μl、10 mmol/L dNTP 0.5 μl、25 μmol/L(c-myc與c-EBPε)或2.5 μmol/L(β-actin)上游及下游引物各0.5 μl、Taq DNA聚合酶1U，用滅菌去離子水補(bǔ)至終體積為25 μl。預(yù)實(shí)驗(yàn)確定產(chǎn)物與循環(huán)之間呈線性關(guān)系范圍。取5 μl反應(yīng)產(chǎn)物在15 g/L瓊脂糖凝膠（含0.5 μg/ml溴化乙錠）電泳，電場(chǎng)強(qiáng)度5 V/cm，紫外燈下觀察電泳結(jié)果，用凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD公司）掃描分析條帶灰度，以目的基因與β-actin的灰度比做半定量分析。Table 1. Sequences of primers，condition of PCR and sizes of PCR products（略）

Western blot

收集藥物處理各組細(xì)胞（細(xì)胞數(shù)為2×106/ml），預(yù)冷的PBS漂洗2次，重懸于100 μl Lammiulis上樣緩沖液（0.125 mmol/L Tris-HCl，pH 6.8，4%SDS，5%甘油）中，超聲波裂解，于4℃離心13 000×g）15分鐘，收集上清，蛋白樣品保存于-80℃。按蛋白定量試劑盒（Bio-Rad公司）操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行蛋白定量，在10%聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)移后的硝酸纖維素膜以5%脫脂奶粉封閉1小時(shí)，分別與抗人c-Myc和抗人β-actin抗體及辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗孵育。ECL顯色，顯影于膠片。圖像分析處理系統(tǒng)（Image Station 2000R）掃描，測(cè)定條帶的面積和灰度，以二者之乘積進(jìn)行半定量比較分析。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理

各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上，以X±D表示，多組間比較F檢驗(yàn)后采用方差分析及Tukey檢驗(yàn)。相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)。應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

結(jié)果

NB4細(xì)胞表面有CD13的表達(dá)

NB4細(xì)胞CD13陽(yáng)性表達(dá)率為94.79%（平均熒光強(qiáng)度為1739.59），對(duì)照組HL-60細(xì)胞CD13陽(yáng)性表達(dá)率為95.49%（平均熒光強(qiáng)度為3107.49）。兩者的CD13平均熒光強(qiáng)度有一定的差異，但陽(yáng)性百分率差異不明顯。

Bestatin與ATRA聯(lián)合處理后NB4細(xì)胞形態(tài)改變明顯

100 μg/ml bestatin單獨(dú)作用72小時(shí)后，NB4細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯改變。10 nmol/L ATRA單獨(dú)作用72小時(shí)后，NB4細(xì)胞呈現(xiàn)部分分化的形態(tài)，細(xì)胞核/漿比例減小，核變小有凹陷。100 μg/ml bestatin與10 nmol/L ATRA聯(lián)合處理72小時(shí)后，NB4細(xì)胞形態(tài)分化更加明顯，細(xì)胞漿內(nèi)空泡增多，核凹陷、扭曲更加明顯，形態(tài)似晚幼粒及桿狀核粒細(xì)胞的細(xì)胞增多（圖1）。

Bestatin與ATRA聯(lián)合應(yīng)用后NB4細(xì)胞NBT還原能力明顯增加

以一定濃度（50、75和100 μg/ml）bestatin單獨(dú)處理72小時(shí)后，NB4細(xì)胞的NBT還原能力無(wú)明顯改變（與空白對(duì)照組相比較，P>0.05）；不同濃度（10、20和40 nmol/L）ATRA作用72小時(shí)后，NB4細(xì)胞的NBT還原能力呈濃度依賴性增加，與空白對(duì)照組相比，差異明顯。100 μg/ml bestatin與不同濃度ATRA聯(lián)合處理72小時(shí)后，NB4細(xì)胞的NBT陽(yáng)性率明顯地提高，與單用相應(yīng)濃度ATRA組相比，差異顯著（表2）。Table 2. Effect of bestatin on the NBT reduction activity of NB4 cells induced by ATRA. (略)

100 μg/ml bestatin單獨(dú)處理細(xì)胞不同時(shí)間（48小時(shí)-96小時(shí)），NB4細(xì)胞的NBT還原能力改變不明顯（與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)空白對(duì)照組相比，P>0.05）；10 nmol/L ATRA處理細(xì)胞至72小時(shí)，開(kāi)始出現(xiàn)NB4細(xì)胞NBT還原能力的增強(qiáng)，并呈時(shí)間依賴性，與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組相比，有明顯差異；而10 nmol/L ATRA與100 μg/ml bestatin聯(lián)合處理48小時(shí)，就出現(xiàn)NB4細(xì)胞NBT還原能力的明顯增強(qiáng)，且此作用隨時(shí)間延長(zhǎng)而明顯增強(qiáng)，與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)單用10 nmol/L ATRA組相比，差異顯著（圖2）。

Bestatin與ATRA聯(lián)合處理后NB4細(xì)胞CD11b表達(dá)明顯增強(qiáng)

100 μg/ml bestatin單獨(dú)處理72小時(shí)后，NB4細(xì)胞CD11b陽(yáng)性表達(dá)率（MFI為13.4±0.6）稍有增加，但與對(duì)照組（MFI為12.3±0.9）相比，差異不顯著（P>0.05）。10 nmol/L ATRA單獨(dú)處理72小時(shí)之后，NB4細(xì)胞CD11b陽(yáng)性表達(dá)率（MFI為19.2±4.2）明顯提高，與對(duì)照組相比，差異顯著（P

Bestatin和ATRA單獨(dú)及聯(lián)合處理后NB4細(xì)胞c-EBPε mRNA表達(dá)的變化

NB4細(xì)胞低表達(dá)c-EBPε mRNA。10 nmol/L ATRA處理12小時(shí)之后，NB4細(xì)胞c-EBPε mRNA表達(dá)水平明顯提高，與對(duì)照組相比較，差異顯著(P

Bestatin和ATRA單獨(dú)及聯(lián)合處理后NB4細(xì)胞c-myc表達(dá)的變化

NB4細(xì)胞c-myc mRNA呈高水平表達(dá)。10 nmol/L ATRA單獨(dú)處理4小時(shí)后，NB4細(xì)胞c-myc mRNA表達(dá)下降，與空白對(duì)照組相比較，差異明顯（P

Figure 4. Effect of bestatin and ATRA on the expression of c-myc mRNA of NB4 cells after treatment for 4 hours. M: marker; Lane 1: control. Lane 2: bestatin (100 μg/ml). Lane 3: ATRA (10 nmol/L). Lane 4: bestatin (100 μg/ml) +ATRA (10 nmol/L).

NB4細(xì)胞c-Myc蛋白呈高表達(dá)。10 nmol/L ATRA單獨(dú)處理8小時(shí)后，NB4細(xì)胞c-Myc蛋白表達(dá)水平明顯下降（P

討 論

ATRA對(duì)APL的有效治療是白血病誘導(dǎo)分化治療的成功典范。但單用ATRA治療易復(fù)發(fā)及產(chǎn)生耐藥，與其他化療藥物聯(lián)用時(shí)療效有一定的提高，但毒副反應(yīng)增加。因此，尋找能夠增強(qiáng)ATRA誘導(dǎo)分化作用而毒副反應(yīng)輕的藥物，成為臨床治療中的關(guān)注問(wèn)題之一［7，8］。最近，Hirano等［7］根據(jù)NBT還原實(shí)驗(yàn)結(jié)果提出，bestatin可能增強(qiáng)ATRA對(duì)NB4細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用，但未做進(jìn)一步的研究。本研究通過(guò)對(duì)細(xì)胞形態(tài)、功能和表面分化抗原等多層次的檢測(cè)及分析對(duì)比，表明一定濃度范圍的bestatin本身不能誘導(dǎo)NB4細(xì)胞分化，但確能增強(qiáng)ATRA對(duì)NB4細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用。

Hirano等［7］認(rèn)為，bestatin增強(qiáng)ATRA誘導(dǎo)分化作用可能與其抑制細(xì)胞表面CD13活性有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，與HL-60細(xì)胞相似，NB4細(xì)胞表面CD13陽(yáng)性表達(dá)率高達(dá)94.79%，該藥是否通過(guò)抑制CD13表達(dá)從而增強(qiáng)ATRA誘導(dǎo)NB4細(xì)胞分化的作用，尚待進(jìn)一步研究證實(shí)。髓系祖細(xì)胞定向分化受轉(zhuǎn)錄因子活性的調(diào)節(jié)。ATRA調(diào)節(jié)與髓細(xì)胞定向分化有關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)誘導(dǎo)APL細(xì)胞向中性粒細(xì)胞分化。氨基肽酶N/CD13為Ⅱ型跨膜蛋白，胞內(nèi)端只有8-10個(gè)氨基酸，但最近研究報(bào)道，CD13分子能夠直接參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的過(guò)程［9］。因此，本研究從藥物對(duì)轉(zhuǎn)錄因子影響的角度對(duì)氨肽酶、抑制劑bestatin增強(qiáng)ATRA誘導(dǎo)分化作用的可能機(jī)制進(jìn)行了初步探索。c-EBPε為C-EBP家族轉(zhuǎn)錄因子之一，ATRA誘導(dǎo)NB4細(xì)胞向中性粒細(xì)胞方向分化時(shí)，藥物作用2小時(shí)，c-EBPε mRNA表達(dá)水平即開(kāi)始增高，并持續(xù)增高至細(xì)胞終末分化［10］。而酪氨酸激酶抑制劑STI571增強(qiáng)ATRA誘導(dǎo)NB4細(xì)胞向中性粒細(xì)胞分化時(shí)，c-EBPε基因及蛋白的表達(dá)水平均未進(jìn)一步增高［8］。本研究結(jié)果顯示，10 nmol/L ATRA處理12小時(shí)后，NB4細(xì)胞c-EBPε mRNA表達(dá)水平明顯上升，而100 μg/ml bestatin與ATRA聯(lián)合處理NB4細(xì)胞時(shí)，c-EBPε mRNA表達(dá)卻未進(jìn)一步增強(qiáng)。這提示bestatin可能與STI571相似，其增強(qiáng)ATRA對(duì)NB4細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用可能不是通過(guò)調(diào)節(jié)c-EBPε表達(dá)。

原癌基因c-myc表達(dá)異常與髓細(xì)胞性白血病的發(fā)生有關(guān)，抑制c-myc表達(dá)可以促使白血病細(xì)胞分化及誘導(dǎo)細(xì)胞終末分化后的凋亡。本研究結(jié)果顯示，10 nmol/L ATRA單獨(dú)作用能夠使NB4細(xì)胞c-myc的表達(dá)下調(diào)，這與文獻(xiàn)報(bào)道相似［11］。同時(shí)，bestatin與ATRA聯(lián)合應(yīng)用時(shí)c-myc表達(dá)水平的下調(diào)作用較單用ATRA時(shí)更加明顯，且藥物聯(lián)合應(yīng)用各組細(xì)胞的c-myc蛋白表達(dá)水平與藥物誘導(dǎo)的NBT還原能力之間呈明顯的負(fù)相關(guān)。這提示bestatin可能通過(guò)與ATRA協(xié)同下調(diào)c-myc表達(dá)，從而增強(qiáng)ATRA誘導(dǎo)NB4細(xì)胞分化的作用。1，25-(OH)2 D3在誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞分化時(shí)，激活蛋白激酶C，引起c-myc表達(dá)下調(diào)［12］。bestatin是否也通過(guò)激活蛋白激酶C增強(qiáng)ATRA下調(diào)c-myc的表達(dá)，這有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

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