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時(shí)間：2023-06-26 10:18:34
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Abstract：Objective To establish the methods for culture and identification of rat muscle-derived stem cells in vitro.Methods
By two-step method， the rat muscle was digested with type I collagen and trypsin， and the isolated cell suspension was purified by different adhesion time . The proliferation ability of muscle-derived stem cells was analysed through studying growth curve， and the obtained cells were identified with cell immunofluroescence technique．Results Highly purified MDSCs were harvested and they showed desmin(+) by cell immunofluroescence technique．Conclusions
MDSCs can be cultured in vitro and can be identified by desmin stain and used to tissue engineering as “seed”cells.
Key words：rat ; muscle derived stem cells ; culture in vitro
近年研究發(fā)現(xiàn)，成體骨骼肌中不但存在單能的成肌干細(xì)胞－衛(wèi)星細(xì)胞，而且還含有多能的“肌源性干細(xì)胞”（muscle derived stem cells，MDSCs）。肌源性干細(xì)胞起源于胚胎血管祖細(xì)胞，在適當(dāng)?shù)奈h(huán)境中，可分化為血細(xì)胞、成骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等不同胚層的組織細(xì)胞，MDSCs的表面標(biāo)志已被初步認(rèn)識(shí)，對(duì)其分化的研究，及其分離純化的技術(shù)研究正在進(jìn)一步深入 ［1-3］。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過技術(shù)改良，通過體外原代培養(yǎng)獲得高純度MDSCs，為組織工程的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 材料 I型膠原酶(Sigma)， 0.25%胰蛋白酶(Hyclone)，胎牛血清(Gibco)，高糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco)，D-Hank’ s(Gibco)，青霉素及鏈霉素(國(guó)產(chǎn))。小鼠抗大鼠Desmin一抗、羊抗小鼠FITC（異硫氰酸熒光黃）(武漢博士德)。
1.2 原代MDSCs的取材、分離純化 參照參考文獻(xiàn)所報(bào)道的方法［4，5］ ，選用新生3～5 d的S－D乳鼠5只；浸入75%的醫(yī)用酒精中，5 min×3次，處死并消毒；無菌條件下取前肢肱三頭肌，后肢腓腸肌，盡可能剔除脂肪、肌腱等結(jié)締組織：用PBS液漂洗2次，將肌組織移入一小平皿，用眼科剪剪成乳糜狀；加入1%的Ⅰ型膠原酶3 mL，37 ℃消化30 min；加入0.25%的胰酶3 mL，37 ℃消化45 min；加入5倍體積的胎牛血清中止消化，反復(fù)吹打后濾過200目的篩網(wǎng)，收集濾液，1 000 r/ min離心7 min，室溫靜置5 min棄上層液，細(xì)胞團(tuán)塊用生長(zhǎng)培養(yǎng)基(含20%胎牛血清的DMEM)重懸，移入培養(yǎng)瓶中，該培養(yǎng)瓶稱為PP1。PP1于37 ℃ 、含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置過夜，隨后將懸液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)膠原包被的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，此為PP2。此后連續(xù)4 d每隔24 h將懸液離心、重懸后轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，分別為PP3～PP6。PP1～PP5棄去不用，PP6用于進(jìn)一步的鑒定實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞在達(dá)到約70%匯合時(shí)必須傳代。
1.3 MDSCs生長(zhǎng)曲線的繪制 取PP6傳至第2代細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，以3.0×104個(gè)／孔接種于24孔培養(yǎng)板。每日取3孔消化后，進(jìn)行細(xì)胞記數(shù)，共7日根據(jù)記數(shù)結(jié)果繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。
2008年2月，29(1)1.4 MDSCs的免疫熒光鑒定 取PP6中的MDSCs培養(yǎng)到第3代時(shí)，把細(xì)胞培養(yǎng)在6孔板中的蓋玻片上，第5 d細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)70%～80%匯合，用75%乙醇固定30 min，PBS洗5 min，2次；加入5%BSA封閉液，常溫下靜置1 h，封閉非特異性結(jié)合，不清洗。滴加小鼠抗大鼠Desmin一抗，37 ℃孵育2 h；PBS洗5 min，3次；滴加羊抗小鼠FITC，避光孵育30 min；PBS洗5 min，3次；50%緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下觀察，照相。
2 結(jié)
果
2.1 分離細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)特性 PP1、PP2（圖1A）貼壁細(xì)胞相對(duì)較少，大部分是長(zhǎng)梭形的成纖維樣細(xì)胞，其余是寬大而呈星形或不規(guī)則的雜細(xì)胞，增殖較快，1周左右即可完全融合。PP3（圖1B）開始即有少量的短梭形、圓形或多角形細(xì)胞貼壁，成纖維細(xì)胞較少。隨著純化的繼續(xù)，圓形或短梭形細(xì)胞的數(shù)量明顯增加，到PP6（圖1C）時(shí)超過80%，這些細(xì)胞貼壁后絕大多數(shù)為梭形或紡錘形， 有兩極， 體積小， 胞核折光性強(qiáng)。少數(shù)細(xì)胞呈多角形， 有突起。隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖、遷移逐漸形成規(guī)律性的平行排列。極易融合，生長(zhǎng)呈方向性，若不加以控制及時(shí)傳代，細(xì)胞可迅速融合成細(xì)胞鏈或聚成團(tuán)塊生長(zhǎng)，細(xì)胞增殖速度減慢， 細(xì)胞相互融合， 形成肌小管（圖1D）。圖1A PP1、PP2貼壁細(xì)胞相對(duì)較少，大部分是長(zhǎng)梭形的成纖維樣細(xì)胞和寬大而呈星形或不規(guī)則的雜細(xì)胞×200
圖1B PP3有少量的短梭形、圓形或多角形細(xì)胞貼壁，成纖維細(xì)胞較少×200
圖1C PP6圓形或短梭形細(xì)胞的數(shù)量明顯增加，超過80% ×200
圖1D 細(xì)胞增殖、遷移逐漸形成規(guī)律性的平行排列。極易融合，生長(zhǎng)呈方向性，細(xì)胞增殖速度減慢，×200
圖1E、F 細(xì)胞特異性desmin染色呈陽性，熒光顯微鏡可見細(xì)胞發(fā)出綠色熒光×400
2.2 生長(zhǎng)曲線 第2日開始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第5日后由于接觸抑制，增殖速度減慢(圖2)。圖2 傳代MDSCs的生長(zhǎng)曲線
2.3 對(duì)PP6的細(xì)胞表型鑒定 肌源性干細(xì)胞本身具有特征性的外形， 其胞漿中含有結(jié)蛋白(desmin) 可通過細(xì)胞免疫熒光方法鑒定。本實(shí)驗(yàn)采用小鼠抗大鼠desmin一抗對(duì)肌源性干細(xì)胞進(jìn)行鑒定，細(xì)胞質(zhì)desmin染色陽性（圖1E，1F），細(xì)胞胞質(zhì)呈現(xiàn)綠色熒光。觀察500個(gè)細(xì)胞，90%為desmin陽性。
3 討
論
近年在骨骼肌中發(fā)現(xiàn)了一群被稱為MDSCs的細(xì)胞群體。預(yù)期它們?cè)诮M織工程應(yīng)用領(lǐng)域特別是細(xì)胞移植和基因治療方面前景廣闊。國(guó)外已在進(jìn)行大量MDSCs介導(dǎo)的相關(guān)的基因治療和組織工程的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)［6-8］，并取得了較明顯的效果。因此建立和完善MDSCs培養(yǎng)方法，獲取高純度的細(xì)胞具有重要實(shí)用價(jià)值。
骨骼肌細(xì)胞是由胚胎的生肌節(jié)和各處的間充質(zhì)細(xì)胞分化而成，在肌膜和基膜之間有一種體積較小的扁平成立方形細(xì)胞，稱為衛(wèi)星細(xì)胞［9］，是保留在成年骨骼肌內(nèi)具有增殖分化能力的單潛能成肌干細(xì)胞，這種組織特異性的干細(xì)胞在出生后骨骼肌的損傷、修復(fù)和維持中起重要作用。有證據(jù)表明新近發(fā)現(xiàn)的肌源性干細(xì)胞(MDSCs)是一群與衛(wèi)星細(xì)胞完全不同的細(xì)胞群?？赡苁且蝗何聪蛉魏畏较蚨ㄐ偷脑几杉?xì)胞。
lee等［7］31-37從骨骼肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了MDSCs，與衛(wèi)星細(xì)胞相比，其具有更多的分化潛能，不僅能分化成骨骼肌纖維，促進(jìn)肌組織再生，還能分化成成骨細(xì)胞，促進(jìn)骨骼愈合［5］，被認(rèn)為是衛(wèi)星細(xì)胞的前體。貼壁前的MDSCs呈小而圓的球形，折光性強(qiáng)，剛貼壁仍為圓形，貼壁后的MDSCs呈紡錘形，延遲分瓶時(shí)會(huì)融合成成熟的多核肌管，這與成纖維細(xì)胞不同。preplate技術(shù)利用差速貼壁獲取MDSCs，其原理是成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞的貼壁能力強(qiáng)于衛(wèi)星細(xì)胞，衛(wèi)星細(xì)胞的貼附能力又強(qiáng)于MDSCs，4 d內(nèi)即可完全貼壁而此時(shí)MDSCs仍處于懸浮狀態(tài)［6］1085-1100，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，組織塊中加入膠原酶后很快就變成了乳糜狀，胰酶對(duì)組織具有很好的離散作用，再通過反復(fù)吹打可將細(xì)胞從基膜中分離出來，得到的細(xì)胞為成纖維細(xì)胞、白細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、衛(wèi)星細(xì)胞及MDSCs的混合物，利用差速貼壁法4 d后處于懸浮狀態(tài)的細(xì)胞移出培養(yǎng)即為純化的MDSCs。MDSCs本身具有特征性外形，我們通過結(jié)蛋白desmin染色鑒定其肌源性，通過其多向分化的能力來鑒定其干細(xì)胞特性。實(shí)驗(yàn)中我們還發(fā)現(xiàn)，隨著乳鼠出生天數(shù)的延長(zhǎng)，所取得的MDSCs的數(shù)量和活力逐漸下降，但出生時(shí)間太短，活力太差，又不利于取材。新出生3～5 d的大鼠最適宜進(jìn)行原代取材。
結(jié)蛋白（desmin）是中間絲蛋白的一種，是成肌分化的早期的標(biāo)志，常作為肌源性的標(biāo)志，雖然成纖維細(xì)胞與骨骼肌內(nèi)血管平滑肌細(xì)胞也產(chǎn)生結(jié)蛋白，但此細(xì)胞中結(jié)蛋白含量低，與抗體產(chǎn)生弱陽性反應(yīng)，且僅有15％的desmin陽性率［10］，而通過本方法獲取的MDSCs中desmin陽性率高達(dá)90%，由此可進(jìn)行初步鑒別。
MDSCs屬于成體干細(xì)胞，具有取材方便、免疫原性低、移植后存活時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，在組織工程和基因治療中具有廣泛的應(yīng)用前景。通過對(duì)常規(guī)技術(shù)的改良，本研究建立了一種穩(wěn)定高效的新生大鼠MDSCs分離純化技術(shù)，并成功對(duì)MDSCs進(jìn)行了鑒定，為MDSCs在基因治療和組織工程的臨床應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。
參考文獻(xiàn)
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【中圖分類號(hào)】R691【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A【文章編號(hào)】1007-8517(2009)10-0125-01
壓力性尿失禁(SUI)為女性的常見病和多發(fā)病，其發(fā)病率約為1 S%-6O%，多發(fā)生于老年人，因受經(jīng)濟(jì)、宗教、教育程度等因素的影響，其實(shí)際發(fā)生率比統(tǒng)計(jì)發(fā)病率更高。SVl的癥狀嚴(yán)重與否都不自接危及生命，但它給患者的日常上作、生活及社交活動(dòng)造成一定程度的影響，甚至?xí)?yán)重影響患者的生活質(zhì)量乃至家庭和睦。
1臨床資料
注射療法是將藥物、化學(xué)制劑或自體組織等注入后尿道或膀肌頸內(nèi)口粘膜下，使尿道腔變窄、拉長(zhǎng)，延長(zhǎng)功能性尿道的長(zhǎng)度，提高尿道阻力，起到關(guān)閉尿道內(nèi)口和后尿道的作用，從而達(dá)到有效控制排尿的口的。這一治療方法對(duì)尿道內(nèi)括約肌功能障礙、尿道內(nèi)壓降低同時(shí)尿道、膀肌無其他病變等壓力性尿失禁患者有較好的效果。注射療法主要優(yōu)點(diǎn)在于.以在局部浸潤(rùn)麻醉下進(jìn)行操作，大多數(shù)患者的手術(shù)均.IJ.以在門診進(jìn)行，適用于老年及不能耐一受大手術(shù)的患者。口前注射療法的研究主要集中在選擇不同的注射材料上，理想的注射材料應(yīng)該在結(jié)構(gòu)上完整，無毒、無免疫原性、無變應(yīng)原性，近期內(nèi)不會(huì)被分解，能長(zhǎng)時(shí)間保持其支撐作用?？谇笆褂玫牟牧仙须y達(dá)到上述要求，因此尋找一種取材方便、生物相容性好、安全無毒、療效滿意的注射材料十分必要。
方法：無菌技術(shù)下獲取SD大鼠雙側(cè)腹股溝區(qū)脂肪墊，消化離心，長(zhǎng)期培養(yǎng)的方法獲取脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞。倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，鑒定其表面分子標(biāo)志。SD大鼠24只分為3組，實(shí)驗(yàn)組（6只），對(duì)照組一（3只），對(duì)照組二（3只）。分別獲取自體ADSCs，實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行熒光標(biāo)記。然后實(shí)驗(yàn)組將熒光標(biāo)記的ADSCs自體移植至尿道周圍，對(duì)照組移植未并取尿道組織進(jìn)行HE染色組織學(xué)分析。
2結(jié)果
原代培養(yǎng)顯示培養(yǎng)的脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞2d左右開始壁,10d-14d左右可達(dá)90%融合,基本上為梭形成纖維樣細(xì)胞形態(tài),免疫細(xì)胞化學(xué)示 CD29陽性，CD34陰性。神經(jīng)切斷術(shù)后10天，除模型組和對(duì)照組一各有1只大鼠死亡外，均進(jìn)行尿流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)，三組手術(shù)前后ALLP分別為：對(duì)照組一為27.1±5.1和29.1±3.2cmH2O，對(duì)照二為29.5±4.9和27.4±72.3,模型組為24.8±3.8和14.7±3.0。模型組手術(shù)后ALLP明顯降低，且組織學(xué)檢查亦證明模型組大鼠尿道周圍括約肌明顯萎縮。
3討論
本實(shí)驗(yàn)將熒光金標(biāo)記的脂肪源性干細(xì)胞自體移植至大鼠的近端尿道周圍，行冰凍切片，組織化學(xué)染色，熒光顯微鏡下觀察.見熒光標(biāo)記的細(xì)胞呈金黃色:后取組抗體免疫移植部位有較多的Desmin陽性的細(xì)胞，棕黃色，部分出現(xiàn)一定的方向性，未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，說明己有細(xì)胞在局部存活并生長(zhǎng)，提示能成為壓力性尿失禁注射治療的一種理想的注射材料，為將來進(jìn)行細(xì)胞移植治療壓力性尿失禁提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
結(jié)論：①大鼠脂肪組織中含有豐富的多能干細(xì)胞。利用消化離心，長(zhǎng)期培養(yǎng)的方法可獲取大量的干細(xì)胞。②移植后大鼠的ADSCs，可以在尿道周圍成活并生長(zhǎng)分化。
參考文獻(xiàn)
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1. 1 材料
1. 1. 1 主要儀器:CO2培養(yǎng)箱、凈化工作臺(tái)、倒置顯微鏡、倒置熒光顯微鏡、共聚焦熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀。
1. 1. 2 主要試劑:DMEM 高糖培養(yǎng)基( Dulbeccosmodified Eagles medium，DMEM)、人表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、0.25%含 EDTA 的胰蛋白酶(0. 25% trysin-EDTA)、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、抗生素(penicillin，streptomycin)、PBS 緩沖液購(gòu)自于 Gibco公司。Oct-4、Sox-2、SSEA-4、nestin、vimentin、BDNF、NGF、CD90 購(gòu)自與 Abcam 公司。CD29、CD44 購(gòu)自于 eBioscience 公司、CD45、CD11b 購(gòu)自于 BD 公司。
1. 1. 3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:SPF 級(jí)孕 18 ～ 18. 5 d 的 SD 大鼠，購(gòu)自中國(guó)軍科院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào):[SCXK-(軍)2014-0004]，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用批準(zhǔn)號(hào):ILAS-PL-2014-001。在無菌條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作分離羊膜組織。
1. 2 方法
1. 2. 1 羊膜細(xì)胞分離及培養(yǎng):SD 孕鼠腹腔注射 1% 戊巴比妥鈉(0. 01 mL /g)，麻醉后，無菌條件下開腹，機(jī)械性分離子宮層，剝離胎盤，分離羊膜組織置于含有500 U/mL 雙抗的 PBS 溶液中沖洗。將羊膜組織放置在含有500 U/mL 雙抗的 DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，無菌眼科剪將其剪至1 mm3左右的小塊。將組織懸液移至50 mL 離心管中，1 000 r/min 離心 5min，棄上清液。加入 0. 25% 含 EDTA 的胰蛋白酶10 mL，37℃ ，5% CO2條件下消化 20 ～30 min。用含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基終止消化。200 目不銹鋼濾網(wǎng)過濾單細(xì)胞懸液，接種至 25 cm2培養(yǎng)瓶，含10% FBS、10 g/LEGF 和 500 U/mL 雙抗的DMEM 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，隔天細(xì)胞換液，2 ～ 3 d 后細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶85% ～90%時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞傳代。
1. 2. 2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè):取培養(yǎng) 2 ～ 4 代細(xì)胞，用0. 25% 含 EDTA 的胰蛋白酶消化，含 10% FBS 的DMEM 完全培養(yǎng)基終止消化。細(xì)胞計(jì)數(shù)將其稀釋成1 106個(gè)，每個(gè)流式管1 mL 細(xì)胞懸液。每流式管加2 mL PBS 使細(xì)胞混勻，2 000 r/min 離心5 min，棄上清液。重復(fù)加2 mL PBS 重懸細(xì)胞，2 000 r/min離心5 min，棄上清液。每管加 50 L PBS 重懸細(xì)胞，加 抗 體 CD29-PE-Cy7、CD44-PE、CD90-FITC、CD45-PE-CY7、CD11b-APC，避光室溫孵育 30 min。每管加2 mL PBS 重懸細(xì)胞2000 r/min 離心5 min，棄上清液。各管加300 L PBS 重懸細(xì)胞上機(jī)檢測(cè)。
1. 2. 3 免疫熒光細(xì)胞染色:取 2 ～ 4 代細(xì)胞，0. 25%含 EDTA 胰蛋白酶消化，含 10% FBS 的 DMEM 完全培養(yǎng)基終止消化。加入完全培養(yǎng)基重懸，至24 孔板中培養(yǎng)。待細(xì)胞增殖至 70% 作用時(shí)，PBS 沖洗，4% 多聚甲醛(預(yù)冷)固定 10 min。PBS 沖洗 2 次，每次5 mim。1% Tuiton-100 孵育10 min。PBS 沖洗2 次，每次 5 mim。山羊血清工作液每孔 100 L 室溫下封閉30 min。吸去山羊血清工作液，抗體稀釋液稀釋抗體 Oct-4(1∶ 200)、Sox-2(1∶ 200)、SSEA-4(1∶200)、nestin(1∶100)、vimentin(1∶100)，每孔100L，4℃過夜孵育。PBS 沖洗 3 次，每次 5 min。避光條件下，PBS 稀釋 FITC 標(biāo)記的羊抗鼠二抗(1∶200)，37℃避光孵育 30 min。PBS 沖洗 3 次，每次5 min。DAPI 封片劑封片。共聚焦熒光顯微鏡觀察。
1. 3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用 x珋 s 表示，使用 SPSS 15.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，對(duì)其進(jìn)行單因素方差分析和LSD 檢驗(yàn)，P 0. 05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié)果
2. 1 分離細(xì)胞培養(yǎng)分離培養(yǎng)大鼠羊膜細(xì)胞，鏡下，細(xì)胞呈變形蟲樣生長(zhǎng)(圖 1a)，生長(zhǎng)速度快(圖 1b)，需隔天換液傳代。本實(shí)驗(yàn)中大鼠羊膜細(xì)胞可傳至6 ～7 代。
2. 2 流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞表面抗原結(jié)果經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)鑒定大鼠羊膜細(xì)胞間充質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)記物 CD29、CD44 分別為97. 6%和95. 8%。細(xì)胞表面抗原CD90、CD45 幾乎不表達(dá)，CD11b 有少量表達(dá)(圖2 見文后彩插6)。
2. 3 細(xì)胞免疫熒光鑒定細(xì)胞表面標(biāo)記物結(jié)果本實(shí)驗(yàn)通過細(xì)胞免疫熒光方法檢測(cè)大鼠羊膜細(xì)胞表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記物 Oct-4 和 Sox-2(如圖 3)，神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記物 nestin 和間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記物vimentin(如圖 4)，( 圖 3 ～ 4 見文后彩插 7) 并表達(dá)胚胎干細(xì)胞標(biāo)記物 SSEA-4(如圖 5)?？杀磉_(dá)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子 BDNF 和NGF(如圖6)(圖5 ～6 見文后彩插8)。
3 討論
Analysis of different protein expressions in different liver cell strains in vitro using SELDI
【Abstract】 AIM: To examine the differential expressions of proteins in hepatoma cell line (HepG2)，hepatoma cell line transfected by HBV （HepG2.2.15）compared with normal liver cell line(LO2) by using surfaceenhanced laser desorption/ionization timeofflight mass spectrometry (SELDITOFMS)， so as to establish a foundation for further studying on the mechanism of hepatoma at the protein level. METHODS: The 3 types of cells above mentioned were cultured as general and collected when they were in good conditions. After cell disruption， SELDITOFMS was employed to detect the differential expressions of proteomes of HepG2， HepG 2.2.15 and LO2. RESULTS: Ninetyone proteins were captured by WCX2 array. Compared with normal liver cell lines， in the segments from Mr 5000 to 15 000， proteins in the HepG2 and HepG2.2.15 showed apparent changes， in which 2 proteins expressions were increased in carcinoma cells， the other 5 decreased. Nine proteins in HepG2 were increased and 10 proteins in HepG 2.2.15 were increased. CONCLUSION: The SELDI ProteinChip technology can be a desired method in detecting the biological markers in the earlier period of hepatoma. This method is of convenience， high sensitivity， and good reproducibility. The biological tags of tissuespecific proteins we found have a potential applying value in the early diagnosis of hepatoma. These tags are also meaningful in screening and identifying signal proteins from serum and tissue specimen in different types of hepatoma. Certain foundation has been established in studying the etiopathogenesis of hepatoma at the level of proteins， as well as the searching of new therapeutic target sites.
【Keywords】 SELDITOFMS; protein array analysis; liver neoplasms; tumor cells， cultured; distinct protein
【摘要】 目的： 運(yùn)用表面增強(qiáng)激光解吸/離子化/飛行時(shí)間質(zhì)譜(SELDITOFMS) 技術(shù)，檢測(cè)體外培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞株（HepG2），轉(zhuǎn)染乙肝病毒的肝癌細(xì)胞株（HepG2.2.15）與正常肝細(xì)胞株（LO2）蛋白質(zhì)的差異表達(dá)，篩選肝細(xì)胞癌的標(biāo)志蛋白，為進(jìn)一步研究肝癌發(fā)病的蛋白質(zhì)組學(xué)機(jī)制奠定基礎(chǔ). 方法： 常規(guī)培養(yǎng)上述3種細(xì)胞，細(xì)胞狀態(tài)良好時(shí)收集細(xì)胞，裂解細(xì)胞后采用 SELDITOFMS技術(shù)用WCX2芯片檢測(cè)HepG2， HepG2.2.15， LO2細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)組學(xué)的差異表達(dá). 結(jié)果： WCX2芯片共捕獲91個(gè)蛋白，在Mr 5000~15 000區(qū)段，與正常肝細(xì)胞株比較，有7個(gè)蛋白質(zhì)在兩種肝癌細(xì)胞中出現(xiàn)明顯變化，其中2個(gè)蛋白在肝癌細(xì)胞中表達(dá)量增高，5個(gè)蛋白在肝癌細(xì)胞中表達(dá)量降低；另外兩種肝癌細(xì)胞株也有其各自的標(biāo)志蛋白，9個(gè)蛋白分子在HepG2表達(dá)量增高，10個(gè)蛋白分子在HepG2.2.15表達(dá)量增高. 結(jié)論： SELDI蛋白芯片技術(shù)檢測(cè)可作為檢測(cè)肝癌早期生物標(biāo)記的方法，它簡(jiǎn)便，敏感性高，重復(fù)性好，本文發(fā)現(xiàn)的這些組織特異性蛋白生物標(biāo)記對(duì)肝癌的早期診斷有潛在的應(yīng)用價(jià)值，對(duì)我們從血清或組織標(biāo)本中篩選和鑒定不同型別肝癌細(xì)胞之間的標(biāo)志蛋白有重要意義，從而為從蛋白質(zhì)水平研究肝癌的發(fā)病機(jī)制及新的治療靶位的尋找奠定了一定的基礎(chǔ).
【關(guān)鍵詞】 表面增強(qiáng)激光解吸/離子化/飛行時(shí)間質(zhì)譜；蛋白質(zhì)陳列分析；肝腫瘤；腫瘤細(xì)胞，培養(yǎng)的；差異蛋白
0引言
原發(fā)性肝癌(HCC)在我國(guó)是常見的惡性腫瘤之一，其死亡率在部分城市中占惡性腫瘤死因的第二位. 每年有11萬人死于肝癌，占全世界肝癌死亡人數(shù)的45%. 肝癌早期沒有明顯體征，多數(shù)病人確診時(shí)已屬晚期，難以治愈，死亡率很高. 所以，對(duì)于肝癌的早期診斷，在無癥狀的人群中發(fā)現(xiàn)早期病例，對(duì)控制肝癌的病死率有現(xiàn)實(shí)的意義. 因此，研究并尋找有價(jià)值的預(yù)警肝癌的標(biāo)志物，成為進(jìn)一步提高肝癌臨床治療水平的關(guān)鍵. 任何疾病在出現(xiàn)病理變化之前，細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)在成分和數(shù)量上都會(huì)有相應(yīng)的改變，癌癥的發(fā)生是一個(gè)多基因多階段多因子的動(dòng)力學(xué)過程，HCC也不例外，目前對(duì)肝癌發(fā)生機(jī)制的研究大都是在基因水平，但是mRNA的水平并不能真正代表所表達(dá)的蛋白質(zhì)水平，因此，要求對(duì)生物功能的執(zhí)行者蛋白質(zhì)進(jìn)行研究.
蛋白質(zhì)組是指一個(gè)基因組、一個(gè)細(xì)胞或組織或一種生物體所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)［1］. 蛋白質(zhì)組學(xué)（Proteomics）是蛋白質(zhì)組概念的延伸，是在整體水平上研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)組成及其活動(dòng)規(guī)律的學(xué)科. 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)為研究腫瘤標(biāo)志物與腫瘤進(jìn)展轉(zhuǎn)移研究提供良好的技術(shù)平臺(tái)， 為研究開辟了新的手段和視角. SELDI蛋白質(zhì)芯片技術(shù)是近年來新興的一種蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，它具有簡(jiǎn)單、快捷、靈敏等特點(diǎn)，可以檢測(cè)分子量在Mr 500~500 000之間的蛋白或多肽，而且所需樣本體積小（0.5~400 μL）［2-3］. 我們應(yīng)用細(xì)胞裂解液裂解體外培養(yǎng)的3種細(xì)胞（LO2， HepG2， HepG2.2.15），進(jìn)行了表面增強(qiáng)激光解吸/離子化/飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)（SELDITOFMS）分析，初步建立了正常肝細(xì)胞、肝癌細(xì)胞與轉(zhuǎn)染乙肝病毒的肝癌細(xì)胞的蛋白表達(dá)圖譜［4］，發(fā)現(xiàn)了一系列（信噪比）差異表達(dá)的蛋白，為今后從血清或肝癌組織中篩選標(biāo)志蛋白提供科學(xué)依據(jù).
1材料與方法
1.1材料正常肝細(xì)胞株（LO2）購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)；肝癌細(xì)胞株（HepG2）及攜帶乙肝病毒的肝癌細(xì)胞株（HepG2.2.15）由第四軍醫(yī)大學(xué)吳力克主任醫(yī)師贈(zèng)送. HPLC水，乙晴，三氟乙酸，白芥子酸（SPA），TritonX100，尿素，4羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES），表面活性劑（CHAPS）均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，蛋白質(zhì)芯片時(shí)間質(zhì)譜分析儀（PBSⅡC）及WCX2（弱陽離子交換芯片）購(gòu)自美國(guó)Ciphergen Biosystems公司.
1.2方法
1.2.1細(xì)胞總蛋白質(zhì)的提取LO2， HepG2細(xì)胞采用含100 mL/L胎牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，HepG2.2.15細(xì)胞另外加入終濃度200 g/L的G418，細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，用無菌細(xì)胞刮刀刮取細(xì)胞，PBS洗3次，加入裂解液（8 mol/L urea， 40 g/L CHAPS， 40 mmol/L TrisHCl， pH 7.4）200 μL， 4℃劇烈震蕩30 min， 20 817 g離心30 min. 上清采用日本日立的 Gene Spec V蛋白核酸分析系統(tǒng)測(cè)定蛋白濃度，用裂解液調(diào)節(jié)至所有樣品濃度為2 g/L，其余上清分裝-86℃?zhèn)溆? 每種細(xì)胞收獲3次，以排除組間差別. 每份樣品至少在2個(gè)以上的同種芯片上檢測(cè)，以排除不同芯片間的差異.
1.2.2WCX2蛋白芯片操作步驟將芯片裝入蛋白工作平臺(tái)，每孔加入200 μL結(jié)合/洗脫緩沖液（50 mmol/L NaAc， pH 4.0）預(yù)處理芯片，室溫下200 r/min振蕩5 min，棄緩沖液，重復(fù)上述操作1次. 每孔加入50 μL 1∶2稀釋的樣品，劇烈震蕩，室溫孵育1 h. 棄掉樣品，每孔用200 μL結(jié)合/洗滌緩沖液洗滌2次，每次震蕩5 min. 棄去孔中液體，每孔加入200 μL HPLC 水，立刻甩出. 從蛋白工作平臺(tái)中取出芯片，空氣中干燥，每孔加入0.5 μL EAM（SPA中加入75 μL乙氰和75 μL 10 mL/L三氟乙酸）重復(fù)1次. 干燥后用蛋白質(zhì)芯片閱讀機(jī)進(jìn)行質(zhì)譜分析.
1.2.3數(shù)據(jù)采集和結(jié)果分析用加有Allinone標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白的NP20芯片校正質(zhì)譜儀，儀器參數(shù)設(shè)置如下： 激光強(qiáng)度220，檢測(cè)敏感度10，優(yōu)化分子質(zhì)量范圍為Mr 2000~10 000，最高分子量為Mr 50 000，采用Ciphergen ProteinChip 3.0版本的分析軟件自動(dòng)采集數(shù)據(jù)，然后用Biomarker Wizard 軟件分析LO2， HepG2， HepG2.2.15細(xì)胞的蛋白質(zhì)譜差異.
2結(jié)果
2.1重復(fù)性試驗(yàn)為了保證試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，我們首先進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)為1010/L，樣品蛋白濃度為2 g/L以減少細(xì)胞本身蛋白的差異；同時(shí)每種細(xì)胞收獲3次，以排除組間差別；每份樣品至少在同種芯片3個(gè)以上不同點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，以排除不同芯片點(diǎn)之間的差異. 然后用SELDITOFMS對(duì)樣品孔進(jìn)行測(cè)定，經(jīng)質(zhì)譜分析后選擇了8個(gè)蛋白峰，測(cè)變異系數(shù)，結(jié)果顯示其M/Z及強(qiáng)度的CV分別為1%， 5%，分析結(jié)果表明試驗(yàn)重復(fù)性好，結(jié)果可靠.
2.2差異蛋白的比較
2.2.1LO2， HepG2， HepG2.2.15三者比較明顯差異蛋白峰共7個(gè)，其中Mr 7945， 7979在肝癌細(xì)胞中表達(dá)增高， 5818， 8428， 10 106， 10 312， 11 084在肝癌細(xì)胞中表達(dá)降低（圖1）.
2.2.2肝癌細(xì)胞和轉(zhuǎn)染乙肝病毒的肝癌細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)差異HepG2， HepG2.2.15細(xì)胞差異蛋白峰共19個(gè)， 9個(gè)蛋白峰在肝癌細(xì)胞中表達(dá)增高，10個(gè)蛋白峰在肝癌細(xì)胞中表達(dá)降低（圖2）.
2.2.3差異蛋白質(zhì)的初步鑒定將發(fā)現(xiàn)的差異蛋白峰在Swiss蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索（us.expasy.org/tools/tagident.html），發(fā)現(xiàn)Mr 11 084.0蛋白峰與鈣結(jié)合蛋白S100 A10相符. 其他幾種蛋白暫時(shí)尋找不到.
A： LO2細(xì)胞；B： HepG2.2.15細(xì)胞；C： HepG2細(xì)胞. 上部分為蛋白峰表達(dá)情況: 橫坐標(biāo)表示相對(duì)分子量，縱坐標(biāo)表示蛋白質(zhì)峰的強(qiáng)度；Mr 11 084.6， 10 106.4蛋白在LO2中表達(dá)最高，在HepG2中次之，在HepG2.2.15中最低. 下部分為蛋白質(zhì)圖譜的模擬凝膠圖： Mr 11 084.6， 10 106.4兩條帶是LO2， HepG2.2.15和HepG2細(xì)胞的差異蛋白.
圖13種細(xì)胞在Mr 10 000~11 500區(qū)段的蛋白質(zhì)檢測(cè)結(jié)果（略）
A: Chip 19C G2; B: Chip 19H 2.2.15. 橫坐標(biāo)表示相對(duì)分子量，縱坐標(biāo)表示蛋白質(zhì)峰的強(qiáng)度. Mr 10 106.4， 11 084.0， 11 658.4蛋白在HepG2中高表達(dá)，在HepG2.2.15中低表達(dá).
圖2HepG2， HepG2.2.15細(xì)胞在Mr 10 000~12 000區(qū)段的蛋白質(zhì)檢測(cè)結(jié)果（略）
3討論
腫瘤早期就可在蛋白質(zhì)水平出現(xiàn)細(xì)微但重要的組合改變［5］，近來研究表明，腫瘤性疾病從蛋白質(zhì)組學(xué)的角度又可以被認(rèn)為是一種蛋白質(zhì)缺陷病，其發(fā)生過程中有多種蛋白會(huì)發(fā)生異常變化. 從組織增生產(chǎn)生原位癌到產(chǎn)生癌變的過程中，有不同的功能性蛋白的參與；轉(zhuǎn)移也是多步驟復(fù)雜連續(xù)的過程， 與轉(zhuǎn)移有關(guān)的特殊基因受到激活并有多種水解酶的參與. 總之， 腫瘤在發(fā)生發(fā)展轉(zhuǎn)移的過程中， 在分子水平有不同的功能性蛋白參與， 并且功能性蛋白很可能在各個(gè)環(huán)節(jié)相互協(xié)調(diào)共同表達(dá). 蛋白表達(dá)異常不僅包括蛋白表達(dá)量的增加或減少，還包括蛋白翻譯后加工上的改變，從而導(dǎo)致腫瘤組織表達(dá)的蛋白質(zhì)譜(protein profile) 的改變. 因此利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法檢測(cè)蛋白質(zhì)譜的變化可以更加準(zhǔn)確地診斷腫瘤及了解腫瘤的發(fā)病機(jī)制.
臨床上現(xiàn)有的HCC標(biāo)志物眾多，但尚無單一標(biāo)志物能夠診斷所有HCC. 這就需要探索一種新的技術(shù)以發(fā)現(xiàn)早期腫瘤標(biāo)志物. SELDI蛋白質(zhì)芯片技術(shù)可檢測(cè)疾病進(jìn)展中不同階段血清中多肽量的變化，翻譯后修飾的改變或某些多肽的聚糖結(jié)構(gòu)變化，為HCC腫瘤標(biāo)志物的進(jìn)展提供了一個(gè)新的方法，它靈敏度高、特異性好、重復(fù)性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單且微量化［6］，可同時(shí)檢測(cè)血清中的多種蛋白質(zhì)已被應(yīng)用于檢測(cè)多種生物學(xué)樣品.
體外培養(yǎng)的細(xì)胞株雖然不能完全反映體內(nèi)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和生物學(xué)活性，但它具有成分單一、均質(zhì)性好、實(shí)驗(yàn)條件容易控制等優(yōu)點(diǎn). 尤其在做對(duì)比性研究時(shí)可避免由組織細(xì)胞成分復(fù)雜，細(xì)胞異質(zhì)性高等缺點(diǎn)造成的結(jié)果不真實(shí)和不可靠［7］. 我們培養(yǎng)了LO2， HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞，裂解細(xì)胞蛋白定量后SELDITOFMS分析蛋白表達(dá)的差異. WCX2芯片，用于分析正電荷蛋白，弱陽離子碳化合物構(gòu)成活性位點(diǎn)，與樣品中賴、精或組氨酸反應(yīng)，它捕獲的蛋白pI一般大于4. 我們?cè)诜肿恿縈r 3000~30 000范圍內(nèi)，共捕獲91個(gè)蛋白峰. 其中肝癌細(xì)胞株與正常肝細(xì)胞株差異蛋白共7個(gè)，不同亞型肝癌細(xì)胞與正常肝細(xì)胞比較有共同的差異蛋白，說明在肝癌的發(fā)生或發(fā)展過程中涉及到一些共同的蛋白質(zhì)改變；我們對(duì)不同類型的肝癌細(xì)胞株差異蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果HepG2， HepG2.2.15細(xì)胞差異蛋白峰共19個(gè)，表明不同肝癌細(xì)胞株也具有特異的差異蛋白，這對(duì)我們從血清或組織標(biāo)本中篩選和鑒定不同型別肝癌細(xì)胞之間的標(biāo)志蛋白有重要意義.
這些組織特異性蛋白生物標(biāo)記對(duì)我們從血清或組織標(biāo)本中篩選或鑒定標(biāo)志蛋白有重要意義，對(duì)肝癌的早期診斷有潛在的應(yīng)用價(jià)值，更主要的是為研究肝細(xì)胞癌變機(jī)制提供了一個(gè)基礎(chǔ)，而且這些蛋白有可能為肝癌治療提供新的靶位，可以進(jìn)行RNA干擾來阻斷其高表達(dá)或通過基因?qū)雭泶龠M(jìn)低表達(dá)蛋白的表達(dá).
用Swiss蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索分子量和pI值匹配的蛋白質(zhì)發(fā)現(xiàn)Mr 11 084蛋白峰可能為鈣結(jié)合蛋白S100 A10. S100蛋白家族是一個(gè)有21個(gè)成員的鈣結(jié)合蛋白家族， S100蛋白通過對(duì)鈣離子的調(diào)節(jié)及與靶蛋白的相互作用，在體內(nèi)發(fā)揮多種生物學(xué)功能. 研究發(fā)現(xiàn) S100家族與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，它們參與細(xì)胞周期調(diào)控，在多種腫瘤中表達(dá)異常，并與腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移有關(guān). S100 A10在腫瘤發(fā)生中的作用還不確定，它可能與Annexin II（p36）組成復(fù)合物，抑制p36磷酸化，參與細(xì)胞周期調(diào)控［8］. 在肝癌的發(fā)生中S100 A10可能通過p36起作用，它在肝癌細(xì)胞 HEPG2中低表達(dá)，抑制p36磷酸化的作用降低，從而抑制細(xì)胞增殖的作用降低，可能引起細(xì)胞生長(zhǎng)失控而致癌.
從理論上講，肝癌在發(fā)生、發(fā)展過程中其細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)變化可以反應(yīng)到血清中，可從體外培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞株中篩選出部分與癌病人血清相一致的標(biāo)志蛋白，有些改變可能只存在于細(xì)胞內(nèi)而不分泌或代謝到細(xì)胞外，這部分蛋白可能是與癌癥的發(fā)病密切相關(guān)的功能蛋白和調(diào)節(jié)蛋白.
目前，我們正進(jìn)一步研究HBV感染攜帶者與HCC患者及正常人血清蛋白質(zhì)的差異表達(dá)，結(jié)合體外培養(yǎng)細(xì)胞株的研究通過對(duì)比分析進(jìn)一步篩選差異蛋白，下一步我們將蛋白純化后進(jìn)行序列測(cè)定，應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜分析鑒定特定的蛋白，以期確認(rèn)肝癌的標(biāo)志蛋白和功能蛋白，為臨床肝癌的診斷提供新的思路，以期使肝癌的血清學(xué)診斷成為可能.
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信息技術(shù)是伴隨計(jì)算機(jī)和網(wǎng)絡(luò)技術(shù)的發(fā)展而發(fā)展的，如今信息技術(shù)已經(jīng)進(jìn)入了發(fā)展的全盛時(shí)期，信息技術(shù)的發(fā)展對(duì)人們的生活、學(xué)習(xí)及工作方式產(chǎn)生了廣泛而深刻的影響。在此背景之下，政工干部的培養(yǎng)工作也不免受到信息技術(shù)發(fā)展的影響，如何準(zhǔn)確地把握信息技術(shù)發(fā)展水平及趨勢(shì)對(duì)于政工干部培養(yǎng)產(chǎn)生的影響，科學(xué)利用信息技術(shù)的強(qiáng)大功能來提高政工干部培養(yǎng)的質(zhì)量，是所有企事業(yè)單位需要思考的問題，婦幼保健院也不例外。
一、信息技術(shù)發(fā)展對(duì)婦幼保健院政工干部培養(yǎng)的影響
1.信息技術(shù)發(fā)展對(duì)政工干部素質(zhì)提出了更高的要求
信息技術(shù)的發(fā)展使得信息化素質(zhì)成為政工干部的基本素質(zhì)之一，婦幼保健院的政工干部也不例外。信息化素質(zhì)是指主體所擁有的各種信息品質(zhì)，包括信息智慧、信息道德、信息意識(shí)、信息覺悟、信息潛能和信息心理等內(nèi)容。信息化素質(zhì)能讓政工干部跟上時(shí)展的潮流，掌握最新的信息技術(shù)，也能讓政工干部認(rèn)識(shí)到信息的重要性而自覺地利用信息提高工作質(zhì)量，培養(yǎng)政工干部終身學(xué)習(xí)意識(shí)。婦幼保健院作為醫(yī)療體系的一部分，一些醫(yī)療技術(shù)和醫(yī)療設(shè)備更新速度很快，政工干部必須具備較高的信息化素質(zhì)才能捕捉到這些信息。具體來說，信息技術(shù)的發(fā)展要求婦幼保健院的政工干部全面提高自身素質(zhì)，學(xué)好信息知識(shí)、掌握信息技能的同時(shí)，還要學(xué)習(xí)政工理論知識(shí)、醫(yī)療專業(yè)知識(shí)及人文社科知識(shí)等，培養(yǎng)政工干部的領(lǐng)導(dǎo)管理能力、溝通交流能力等。
2.信息技術(shù)發(fā)展對(duì)政工干部素質(zhì)培養(yǎng)提供了新的條件
信息技術(shù)的發(fā)展改變了傳統(tǒng)的信息的載體形式，拓寬了信息傳播的渠道，極大地縮短了信息傳播所需要的時(shí)間，使個(gè)人獲得信息的成本大大降低，為政工干部的培養(yǎng)創(chuàng)造了有利的條件。首先，政工干部學(xué)習(xí)、溝通渠道更廣。婦幼保健院可以在政工干部的培養(yǎng)課程中使用各種計(jì)算機(jī)輔助教學(xué)方式，它使課程內(nèi)容更加生動(dòng)有趣，能更好地激發(fā)政工干部的學(xué)習(xí)興趣；依靠網(wǎng)絡(luò)教學(xué)的方式還可以讓政工干部充分利用網(wǎng)上豐富的信息資源，相互交流學(xué)習(xí)；此外政工干部還可以合理安排自己的學(xué)習(xí)時(shí)間，選擇自己的學(xué)習(xí)方式，培養(yǎng)方式更加個(gè)性化。其次，政工干部利用信息的方式發(fā)生了改變。過去婦幼保健院的政工干部獲取信息主要靠閱讀各種紙質(zhì)材料，現(xiàn)在政工干部閱讀的載體擴(kuò)展到網(wǎng)絡(luò)信息，從文字?jǐn)U展到圖像、聲音、三維等；在表達(dá)方式上實(shí)現(xiàn)了從直接手寫到鍵盤輸入、掃描等，包括直接復(fù)制或者刪減其他文件；在計(jì)算方式上也不再需要人工計(jì)算，利用計(jì)算機(jī)準(zhǔn)確又迅速減輕了政工干部數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析的負(fù)擔(dān)。
3.信息技術(shù)發(fā)展對(duì)政工干部素質(zhì)培養(yǎng)帶來的問題
首先，信息鴻溝現(xiàn)象比較嚴(yán)重。在婦幼保健院的政工部門中，政工干部的能力有高有低，在掌握和使用現(xiàn)代信息技術(shù)方面也存在較大差異，這給政工干部的信息培養(yǎng)課程增加了不小的難度。其次，網(wǎng)絡(luò)信息量過于龐大。信息技術(shù)的發(fā)展使得，各種信息都能在網(wǎng)絡(luò)上迅速傳播，過量的信息會(huì)使人們很難找到自己所需要的信息，造成信息利用效率的下降，其中一些有害的信息更是嚴(yán)重影響政工干部的培養(yǎng)工作。
二、提高婦幼保健院政工干部培養(yǎng)質(zhì)量的對(duì)策
1.定期完善政工干部培養(yǎng)方案
信息技術(shù)的發(fā)展變化是日新月異的，婦幼保健院要保證政工干部的培養(yǎng)緊跟時(shí)代的步伐就必須根據(jù)時(shí)代的變化對(duì)培養(yǎng)方案和教學(xué)計(jì)劃進(jìn)行全面的調(diào)整和修訂，但是不能改變的是要始終強(qiáng)調(diào)培養(yǎng)信息化素質(zhì)的重要性。培養(yǎng)方案的完善和修改可以從以下幾方面入手：教學(xué)目標(biāo)、教學(xué)內(nèi)容、教學(xué)課程專題、教師師資、教學(xué)材料和教學(xué)組織形式等，要突出強(qiáng)調(diào)信息化素質(zhì)的地位。
2.精心設(shè)計(jì)培養(yǎng)的專題體系
婦幼保健院政工干部培養(yǎng)的基本平臺(tái)就是課程專題，怎樣設(shè)計(jì)合理的課程專題也成為政工干部培養(yǎng)工作的難題，可以明確的是必須要依據(jù)信息技術(shù)的發(fā)展對(duì)各類政工干部知識(shí)能力素質(zhì)的客觀要求來建立課程專題體系，同時(shí)也要根據(jù)不同教學(xué)對(duì)象的性質(zhì)、層次和類型做出調(diào)整。要根據(jù)政工干部的培養(yǎng)目標(biāo)確定專題的類別和課時(shí)比例，各類專題都有圍繞解決新時(shí)期思想政治教育工作來設(shè)計(jì)，專題設(shè)置和內(nèi)容都要做到內(nèi)容精干、素材新穎、實(shí)在管用，不僅要包括信息化知識(shí)和技術(shù)的課程，還要有其他方面的課題。
3.打造政工干部培養(yǎng)的環(huán)境條件保障體系
婦幼保健院可以從以下幾個(gè)方面來支持政工部門的信息化工作。首先，配置完備的教學(xué)設(shè)施設(shè)備，包括計(jì)算機(jī)及網(wǎng)絡(luò)、多功能教室等。其次，建設(shè)多樣的信息化教學(xué)信息資源子系統(tǒng)，例如數(shù)字化圖書館信息資源、課程網(wǎng)絡(luò)信息資源、教學(xué)管理信息資源等。
總之，為了讓信息技術(shù)的發(fā)展更好地為婦幼保健院的政工干部培養(yǎng)工作服務(wù)，需要站在全局的高度將信息技術(shù)理論和方法應(yīng)用到培養(yǎng)的全過程中，需要對(duì)政工干部培養(yǎng)的形式、內(nèi)容、方法進(jìn)行深刻變革，以提高政工干部培養(yǎng)的效率，全面提高政工干部信息化素質(zhì)培養(yǎng)的質(zhì)量和效益。
參考文獻(xiàn)：
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目的 ：研究糖尿病是否會(huì)導(dǎo)致在體外培養(yǎng)條件下自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖、分泌和抗凋亡能力的改變。方法：利用鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)制作成年大鼠糖尿病模型（n=6），正常大鼠作為對(duì)照組（n=6），分別于體外利用全骨髓貼壁法來擴(kuò)增和純化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后，取生長(zhǎng)良好的第2代細(xì)胞作為本實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象。采用Cell Count kit-8（CCK-8）分別繪制兩組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線來評(píng)價(jià)增殖能力；采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（IGF-1）的分泌量；應(yīng)用Hoechst33342染色和膜聯(lián)蛋白V/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞在低氧無血清條件下的抗凋亡能力。結(jié)果：來源于糖尿病大鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖較正常的大鼠顯著性減慢（P
【關(guān)鍵詞】 糖尿病 間充質(zhì)干細(xì)胞 VEGF 細(xì)胞凋亡 增殖 大鼠
Abstract: Objective: To study the effect of diabetic inner environment on the biological properties of marrow mesenchymal stem cells derived from bone(BMSCs). Methods: BMSCs were harvested from the normal and diabetic rats induced by streptozotocin (STZ). Cell proliferation was evaluated using cell counting kit-8 (CCK-8) assay. The secretory volume of vascular endothelial growth factor (VEGF) and insulin-like growth factor (IGF-1) were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and the anti-apoptosis capacity of the cell under the hypoxia and serum deprivation (hypoxia/SD) was detected by Hoechst33342 staining and annexin V/PI dual-color flow cytometry. Results: BMSCs from the diabetic rats induced by STZ could be successfully harvested and expanded in vitro. However they showed more spread-out and flattened appearance and larger size. The proliferative ability of diabetic rats derived from BMSCs were significantly decreased compared with the normal rats (P
Key words: diabetes；mesenchymal stem cells；vascular endothelial growth factor；apoptosis；proliferation；rats
干細(xì)胞治療心肌梗死已被證實(shí)是一種較有前景的治療方法。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone mar-row mesenchymal stem cells，BMSCs）由于具有取材容易、體外增殖能力強(qiáng)、低免疫原性、可分化為不同類型的成熟細(xì)胞等優(yōu)點(diǎn)[1-2]，成為最佳的移植細(xì)胞來源。但是和其他體細(xì)胞類似，BMSCs也易受各種因素如：年齡、氧化應(yīng)激和高糖[3-4]等的影響而導(dǎo)致其生物學(xué)性狀改變。
糖尿病患者復(fù)雜的體內(nèi)環(huán)境，包括長(zhǎng)期的高血糖、高血脂、酮體的增多、活性氧等，勢(shì)必會(huì)對(duì)自身體內(nèi)的BMSCs產(chǎn)生影響[5-6]。目前國(guó)內(nèi)外在干細(xì)胞治療心梗的研究中，大多采用正?；蛘吣贻p的BMSCs作為移植細(xì)胞來源。為了確定糖尿病體內(nèi)環(huán)境對(duì)BMSCs的影響以及其能否作為自體移植的細(xì)胞來源，我們將以糖尿病大鼠來源的BMSCs作為研究對(duì)象，在體外培養(yǎng)條件下進(jìn)行一系列的生物學(xué)特性檢測(cè)，就此問題進(jìn)行初步探討。
1 材料和方法
1.1 動(dòng)物
220 g Spraque Dawley(SD)大鼠由溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，所有研究都經(jīng)溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物委員會(huì)批準(zhǔn)。
1.2 主要試劑
DMEM、胰蛋白酶、胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；鏈脲佐菌素（STZ）、Hoechst 33342購(gòu)自Sigma公司；細(xì)胞低氧培養(yǎng)盒、缺氧催化劑購(gòu)自BioM6rieux-sa(France)；膜聯(lián)蛋白 (annexin)-V FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京寶賽生物公司；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒購(gòu)自R&D公司。
1.3 糖尿病大鼠模型的制備
12只健康的SD大鼠隨機(jī)平均分為兩組，分別為糖尿病組和正常對(duì)照組。兩組大鼠在禁食12 h后分別予單次腹腔注射STZ檸檬酸緩沖液(55 mg/kg)和檸檬酸緩沖液。3 d后剪尾靜脈測(cè)血糖，以>16.67 mmol/L視為糖尿病模型成功，腹腔注射后3周復(fù)測(cè)1次尾靜脈血糖和體重，以確保血糖濃度>16.67 mmol/L。糖尿病模型合格的和正常對(duì)照組大鼠繼續(xù)飼養(yǎng)10周，為下面實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。
1.4 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)
無菌條件下分別剝離糖尿病大鼠和正常對(duì)照大鼠的股骨和脛骨[3]，以全骨髓貼壁法分離并培養(yǎng)BMSCs，待狀態(tài)良好的第二代細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到70%～80%匯合時(shí)可用于以下實(shí)驗(yàn)。
1.5 細(xì)胞增殖能力檢測(cè)
取生長(zhǎng)良好的第二代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，于96孔板的每個(gè)孔中加入100μL細(xì)胞懸液，細(xì)胞數(shù)為1.5×103，培養(yǎng)基每2天更換一次。于細(xì)胞接種后的7 d內(nèi)，每天取5個(gè)孔進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)孔內(nèi)加入CCK-8試劑10μL，置培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h后，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm（參比波長(zhǎng)630 nm）的吸光度值（OD值），取平均值，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的OD值為縱坐標(biāo)，描繪生長(zhǎng)曲線。
1.6 間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡的檢測(cè)
1.6.1 細(xì)胞模擬缺血處理(無血清和低氧聯(lián)合處理)：當(dāng)?shù)诙?xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到70%～80%匯合時(shí)用PBS沖洗2次，加入不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，然后迅速將細(xì)胞放入密閉低氧罐中，置于37 ℃、5% CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6 h。
1.6.2 形態(tài)學(xué)檢測(cè)：將進(jìn)行低氧和無血清處理后的細(xì)胞用PBS洗1次，然后加入含Hoechst33342的無血清DMEM培養(yǎng)基，Hoechst33342終濃度為0.1 mg/mL，室溫避光反應(yīng)10 min。用熒光顯微鏡觀察，紫外光激發(fā)，觀察凋亡細(xì)胞并攝片。
1.6.3 流式檢測(cè)：取經(jīng)低氧無血清處理的7×105個(gè)細(xì)胞，用0.125%胰蛋白酶/0.04% EDTA消化細(xì)胞后，4 ℃，以800 r/min離心4 min后，棄掉上清液；細(xì)胞用PBS沖洗1次后懸浮于200μL結(jié)合緩沖液。然后加入10μL 20μg/mL的異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V(膜聯(lián)蛋白-V-FITC)，輕輕混勻后，4 ℃避光反應(yīng)15 min。加入5μL 50μg/mL的PI，300μL結(jié)合緩沖液，輕輕混勻，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)活細(xì)胞、早期和中晚期凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞所占的比例。
1.7 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和胰島素生長(zhǎng)因子-1（IGF-1）的ELISA檢測(cè)
將生長(zhǎng)良好的第二代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞用PBS沖洗1次后，添加不含血清DMEM培養(yǎng)基置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6 h后，取上清液備用。按照ELISA試劑盒操作說明書，用雙抗體夾心法分別檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF和IGF-1的含量，每份標(biāo)本設(shè)3個(gè)復(fù)孔。用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)450 nm處吸光度值，取其平均值，根據(jù)所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各個(gè)細(xì)胞因子的含量。
1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法
采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。
2 結(jié)果
2.1 大鼠BMSCs的培養(yǎng)和增殖能力檢測(cè)
采用常規(guī)細(xì)胞原代培養(yǎng)法，成功培養(yǎng)了糖尿病大鼠的BMSCs。相差顯微鏡下對(duì)細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行了觀察，如圖1A所示培養(yǎng)的原代細(xì)胞呈長(zhǎng)梭型，集落生長(zhǎng)，中間較密，夾雜著圓形高亮未貼壁的雜細(xì)胞，但是糖尿病大鼠的BMSCs所形成的集落較正常大鼠的明顯要小，而且貼壁后4~5 d才表現(xiàn)出成纖維樣生長(zhǎng)特性。細(xì)胞傳代后，在第1代和第2代細(xì)胞生長(zhǎng)呈現(xiàn)明顯的漩渦狀，但是相對(duì)于正常大鼠BMSCs飽滿的細(xì)胞形態(tài)，糖尿病大鼠的則表現(xiàn)為細(xì)胞伸展無力，且較為扁平。本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞均為第2代BMSCs。利用CCK-8檢測(cè)的結(jié)果顯示(見圖1B)，糖尿病來源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖能力明顯較正常來源的低（P
2.2 VEGF和IGF-1的分泌量
ELISA結(jié)果（見圖2）顯示糖尿病大鼠來源BMSCs的VEGF和IGF-1的分泌量較正常來源的明顯降低(分別為P
2.3 細(xì)胞凋亡
在缺血無血清聯(lián)合處理后(圖3A)，相差顯微鏡照片可以顯示明顯的細(xì)胞凋亡表征，即胞核皺縮變圓，貼壁細(xì)胞數(shù)量明顯地減少。Hoechst33342染色后，正常細(xì)胞核呈彌散均勻的熒光， 而凋亡的細(xì)胞， 細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中可見濃染致密的顆粒熒光， 被認(rèn)為是典型的凋亡細(xì)胞。
2.4 膜聯(lián)蛋白V/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡膜聯(lián)蛋白
糖尿病來源的BMSCs中早期凋亡細(xì)胞(膜聯(lián)蛋白為V+/PI-）較正常大鼠來源的明顯增多（P 0.05）。
3 討論
隨著冠心病發(fā)病機(jī)制研究的深入，更多的證據(jù)表明，作為代謝綜合征之一的糖尿病和冠心病的發(fā)生有著密切的關(guān)系[5]。而糖尿病患者體內(nèi)的高糖、酮體、氧化產(chǎn)物等有害物質(zhì)的增多，勢(shì)必對(duì)自體來源的BMSCs的性狀產(chǎn)生影響。在本研究中我們通過利用STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型，在經(jīng)體外培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，糖尿病來源的BMSCs在增殖能力上明顯減弱，并且在細(xì)胞的分泌和抗凋亡能力上也較正常大鼠來源的顯著降低。
在BMSCs治療心肌梗死的研究中，首先要在體外擴(kuò)增得到移植所需的細(xì)胞量。我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，在原代培養(yǎng)中糖尿病來源細(xì)胞在貼壁后4～5 d才表現(xiàn)出成纖維樣生長(zhǎng)的特性，且糖尿病來源的BMSCs的增殖能力明顯降低，并且細(xì)胞較為扁平。原代體外貼壁時(shí)間的延長(zhǎng)和細(xì)胞形態(tài)的變化說明其對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力降低，需要較長(zhǎng)的時(shí)間來恢復(fù)其生長(zhǎng)增殖能力。另外有研究表明，傳代后細(xì)胞變?yōu)楸馄?，具有這樣的形態(tài)特征為細(xì)胞衰老的表象[7]，并且與我們所得出的增殖能力的下降是相一致的。
另外在BMSCs移植提高梗死后的心功能上，干細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子被認(rèn)為是提高心功能的主要因素之一[8]，其中VEGF和IGF-1在促進(jìn)新生血管的生成和細(xì)胞增殖方面起著非常重要的作用。我們的研究表明，糖尿病來源的BMSCs其VEGF和IGF-1分泌量較正常來源的明顯降低。Liu等[9]利用高糖培養(yǎng)多功能前體細(xì)胞后，VEGF的分泌量也可以得到類似的結(jié)果，但是其細(xì)胞來源為正常的幼年大鼠。在本實(shí)驗(yàn)中所采用的干細(xì)胞培養(yǎng)條件為正常的培養(yǎng)條件，說明糖尿病的體內(nèi)環(huán)境對(duì)糖尿病來源的干細(xì)胞其分泌能力有不可逆的損害作用。另據(jù)研究表明，VEGF和IGF-1在糖尿病患者的腎臟和視網(wǎng)膜以及血液中的濃度明顯高于正常水平[10]，但是糖尿病自身來源的BMSCs所分泌的VEGF和IGF-1較正常的明顯降低，造成這種矛盾的結(jié)果，可能是不同的組織來源的細(xì)胞對(duì)于糖尿病內(nèi)環(huán)境的反應(yīng)性不同，并且VEGF和IGF-1在糖尿病腎病和視網(wǎng)膜病變等糖尿病并發(fā)癥的發(fā)展中起著重要的作用。至于細(xì)胞移植后分泌的細(xì)胞因子，是否會(huì)加速糖尿病并發(fā)癥的發(fā)展進(jìn)程，需要更深入地研究。
影響干細(xì)胞治療心梗療效的另一重要因素是在干細(xì)胞移植后細(xì)胞在心梗區(qū)的存活率較低，而心肌梗死區(qū)缺血低氧的環(huán)境是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的主要原因。我們采用體外低氧無血清的方法建立細(xì)胞凋亡模型[11]，發(fā)現(xiàn)糖尿病組的抗凋亡能力明顯較正常組下降?，F(xiàn)有的體外研究表明，體外的高糖、丙酮醛類、活性氧產(chǎn)物（ROS）等環(huán)境對(duì)細(xì)胞的凋亡起著很大的促進(jìn)作用，而這些因素在糖尿病患者中均存在。另外，VEGF的分泌減少和糖尿病BMSCs在體外培養(yǎng)條件下的所表現(xiàn)出細(xì)胞衰老的形態(tài)學(xué)特征，抗細(xì)胞凋亡能力的下降也起著重要的促進(jìn)作用。
目前關(guān)于糖尿病大鼠來源的BMSCs在增殖、分泌和抗凋亡能力下降方面的確切機(jī)制目前尚不清楚，可能與糖尿病體內(nèi)復(fù)雜的病理生理?xiàng)l件造成干細(xì)胞的線粒體功能障礙[12]、高糖所導(dǎo)致的細(xì)胞復(fù)制性衰老[3]和相應(yīng)的信號(hào)通道阻斷等有關(guān)[9]。在本實(shí)驗(yàn)中，我們選擇均為同齡的大鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，避免了因年齡不同而造成的誤差；在細(xì)胞培養(yǎng)方面，均在體外正常的培養(yǎng)條件下進(jìn)行，從而可以得出糖尿病對(duì)BMSCs的各種生物學(xué)性狀的損害是客觀存在的。
本研究也存在若干不足，如沒有將培養(yǎng)得到的糖尿病BMSCs移植回動(dòng)物心梗模型體內(nèi)，檢測(cè)其對(duì)心功能的改善情況。另外，在糖尿病來源的BMSCs在抗凋亡能力、增殖能力和分泌能力損傷的機(jī)制上，沒有做進(jìn)一步的探討，這也是我們下一步實(shí)驗(yàn)的方向。
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與ESA均為高水平表達(dá)，而CD184表達(dá)則在12個(gè)細(xì)胞系之間有差異。在單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)中，形成完全克隆、部分克隆與旁克隆3種形態(tài)，12個(gè)細(xì)胞亞系均源于單個(gè)細(xì)胞形成的完全克隆，均可進(jìn)行連續(xù)傳代與擴(kuò)增，而部分克隆與旁克隆則在后續(xù)培養(yǎng)中逐漸衰老與消亡。結(jié)論 Tca8113M1細(xì)胞系中可能存在癌干細(xì)胞，而單細(xì)胞培養(yǎng)可形成完全克隆并建立細(xì)胞亞系，是進(jìn)行舌癌干細(xì)胞后續(xù)研究重要的細(xì)胞培養(yǎng)模式。
[關(guān)鍵詞] 單細(xì)胞； 有限稀釋法； 舌癌干細(xì)胞； 完全克隆
[中圖分類號(hào)] Q 21 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.01.021 癌干細(xì)胞是癌組織中一小群具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞，具有自我復(fù)制與更新的能力，而且增殖與分裂能力極強(qiáng)，少量細(xì)胞即可形成體外移植瘤[1]。近年
有關(guān)腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移、耐藥與復(fù)發(fā)等諸多難題均從癌干細(xì)胞的角度進(jìn)行研究。這種研究的基礎(chǔ)和前提是明確癌干細(xì)胞的標(biāo)志或分離出癌干細(xì)胞，以提供研究的靶細(xì)胞。目前已發(fā)現(xiàn)多種永生性癌細(xì)胞系中存在有癌干細(xì)胞，Tca8113M1舌癌細(xì)胞系同樣可能存在有癌干細(xì)胞，可以作為舌癌干細(xì)胞的研究對(duì)象。鑒于癌干細(xì)胞獨(dú)特的自我復(fù)制與更新能力，本研究以Tca8113M1舌癌細(xì)胞系為研究對(duì)象，采用有限稀釋法分離出單個(gè)舌癌細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，利用癌干細(xì)胞的自我復(fù)制能力進(jìn)行分裂增殖，形成預(yù)期的單細(xì)胞克隆，進(jìn)一步形成細(xì)胞亞系，以此證明Tca8113M1
舌癌細(xì)胞系中存在癌干細(xì)胞的可能性，同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞亞系癌干細(xì)胞標(biāo)志的表達(dá)情況，觀察不同細(xì)胞亞系的生物學(xué)特性，并且動(dòng)態(tài)觀察單細(xì)胞培養(yǎng)中細(xì)胞克隆形成的規(guī)律，為從Tca8113M1細(xì)胞系中分離舌癌干細(xì)胞提供前期實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
1 材料和方法
1.1 舌癌細(xì)胞系來源
人舌癌細(xì)胞系Tca8113由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔頜面外科腫瘤生物實(shí)驗(yàn)室建系，四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院贈(zèng)送。右江民族醫(yī)學(xué)院腫瘤分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室在此基礎(chǔ)上建立了轉(zhuǎn)移人舌癌細(xì)胞系Tca8113M1[2]。
1.2 主要試劑和儀器
胎牛血清（Hyclone公司，美國(guó)），RPMI1640培
養(yǎng)基（Gibco公司，美國(guó)）；PE標(biāo)記抗人CD44抗體，異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的抗人細(xì)胞外可溶性抗原（extracellular soluble anti-
gen，ESA）抗體，PE/cy5標(biāo)記抗人CD184抗體，同
型對(duì)照抗體分別為大鼠IgG2bκ2、小鼠IgG1與小鼠IgG2aκ4。CO2培養(yǎng)箱（日本三洋公司），流式細(xì)胞儀（BD公司，美國(guó)），倒置顯微鏡（Olympus公司，日
本）。
1.3 體外單細(xì)胞培養(yǎng)、建系及細(xì)胞克隆生長(zhǎng)的動(dòng)態(tài)
觀察
采用有限稀釋法進(jìn)行體外單細(xì)胞培養(yǎng)與建系。Tca8113M1細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇后，使用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移至96孔板，采用有限稀釋法保證每個(gè)孔有1個(gè)細(xì)胞，在倒置顯微鏡下觀察其生長(zhǎng)和增殖情況，待其生長(zhǎng)成多個(gè)細(xì)胞克隆后，用0.25%胰蛋白酶消化轉(zhuǎn)移至6孔板擴(kuò)增培養(yǎng)后，在培養(yǎng)瓶中反復(fù)傳代建立細(xì)胞亞系。此外，在此培養(yǎng)過程中動(dòng)態(tài)觀察單個(gè)細(xì)胞形成細(xì)胞克隆的形態(tài)與生長(zhǎng)情況，觀察時(shí)點(diǎn)分別為3 d和1、2、3周。
1.4 舌癌細(xì)胞亞系成瘤性檢測(cè)
建立裸鼠皮下移植瘤模型。體外培養(yǎng)Tca8113、Tca8113M1、Tca8113M1舌癌細(xì)胞亞系細(xì)胞，選取形態(tài)良好的生長(zhǎng)期細(xì)胞，在生長(zhǎng)旺盛時(shí)接種。具體步驟如下：消化收集舌癌細(xì)胞，800 r?min-1離心3～
5 min，棄上清液，計(jì)數(shù)細(xì)胞總量，以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液按每毫升1×107個(gè)細(xì)胞的密度稀釋細(xì)胞；消毒裸鼠右腋窩的皮膚，將細(xì)胞接種于皮下，以皮下結(jié)節(jié)直徑超過1.0 cm為成瘤標(biāo)準(zhǔn)。共接種裸鼠45只，具體分組如下：1）Tca8113M1舌癌細(xì)胞亞系組，共12個(gè)亞系，每組3只，共36只；2）Tca8113M1舌癌細(xì)胞組，6只，為母系細(xì)胞系對(duì)照組；3）Tca8113舌癌細(xì)胞組，3只，為來源細(xì)胞系對(duì)照組。
1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)舌癌細(xì)胞亞系癌干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)
志CD44、CD184、ESA的表達(dá)情況
將舌癌細(xì)胞（密度為每毫升1×106個(gè)）消化以后，800 r?min-1離心5 min，棄上清液，加入D-hanks液重懸，盡量將細(xì)胞吹散，將細(xì)胞懸液分別移入試管中（每管體積為500 μL），設(shè)置對(duì)照管和樣本管。在對(duì)照管中加入同型對(duì)照抗體（分別是大鼠IgG2bκ2、小鼠
IgG1與小鼠IgG2aκ4）各5 μL，在樣本管中加入熒光抗體（PE標(biāo)記抗人CD44、FITC標(biāo)記抗人ESA、PE/cy5
標(biāo)記抗人CD184）各5 μL，置于避光環(huán)境下室溫孵育30 min，然后于流式細(xì)胞儀上檢測(cè)CD44、CD184、ESA的表達(dá)情況。
2 結(jié)果
2.1 Tca8113M1細(xì)胞體外單細(xì)胞建系培養(yǎng)
Tca8113M1單細(xì)胞培養(yǎng)12 h后，細(xì)胞貼壁；24 h后部分細(xì)胞出現(xiàn)變大變薄、空泡樣變等老化現(xiàn)象；3 d后，有7個(gè)孔的細(xì)胞出現(xiàn)增殖分裂現(xiàn)象；7～10 d后有12個(gè)孔的細(xì)胞開始增殖為單個(gè)或數(shù)個(gè)完全細(xì)胞克?。寺⌒纬蛇^程見圖l）。
培養(yǎng)4～6周后，細(xì)胞基本達(dá)到穩(wěn)定生長(zhǎng)并增殖的狀態(tài)，以癌細(xì)胞的克隆樣生長(zhǎng)為主，細(xì)胞呈鋪路石狀，可見巨核、多核細(xì)胞，核分裂象多見。待培養(yǎng)孔接近80%鋪滿時(shí)，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至6孔板上擴(kuò)增培養(yǎng)，1～2周后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中繼續(xù)傳代培養(yǎng)，穩(wěn)定傳代30代后凍存。本研究以有限稀釋法獲取192個(gè)Tca8113M1舌癌單細(xì)胞，并在96孔板中進(jìn)行體外傳代建系培養(yǎng)，獲取12個(gè)細(xì)胞亞系，比例為6.25%，分別命名為Tca8113-S1～Tca8113-S12。
2.2 Tca8113M1細(xì)胞體外單細(xì)胞培養(yǎng)形成細(xì)胞克隆
的動(dòng)態(tài)觀察
以3 d和1、2、3周為觀察時(shí)點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)單個(gè)細(xì)胞形成細(xì)胞克隆的形態(tài)主要有3種：完全克隆、部分克隆、旁克隆。Tca8113-S1～Tca8113-S12細(xì)胞亞系的細(xì)胞均源于單個(gè)細(xì)胞形成的完全克隆，均可以進(jìn)行連續(xù)傳代與細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增，而其他單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)形成的部分克隆與旁克隆則在后續(xù)培養(yǎng)中逐漸衰老與消亡，未能連續(xù)傳代進(jìn)行細(xì)胞擴(kuò)增。3種克隆在培養(yǎng)過程中的變化情況如下。1）完全克隆：細(xì)胞之間緊湊密集成型，增殖速度快，其中1～2周為典型的完全克隆狀，3周時(shí)在細(xì)胞克隆中央出現(xiàn)細(xì)胞重疊生長(zhǎng)現(xiàn)象（圖2中A1～A4）；2）部分克?。嚎寺⌒螒B(tài)界于旁克隆與完全克隆之間，細(xì)胞間較疏松，其中1～2周為典型的部分克隆狀，但第3周細(xì)胞克隆疏松，形狀消散，
有轉(zhuǎn)變?yōu)榕钥寺〉内厔?shì)（圖2中B1～B4）；3）旁克?。?/p>
細(xì)胞間疏松不成型，第1周較典型，第2、3周后細(xì)胞老化（圖2中C1～C4）。
2.3 Tca8113M1舌癌細(xì)胞亞系成瘤情況
將舌癌細(xì)胞亞系Tca8113-S1～Tca8113-S12接種于裸鼠皮下后，1周后可觸及皮下結(jié)節(jié)，表面光滑、質(zhì)硬、可活動(dòng)；2周后可見皮下結(jié)節(jié)生長(zhǎng)迅速；3～4周后皮下結(jié)節(jié)最大直徑達(dá)1.0 cm以上。含對(duì)照組在內(nèi)的45只裸鼠均接種成瘤，成瘤率為100%。
2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞亞系癌干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志
CD44、CD184、ESA表達(dá)情況
流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果見表1：除了Tca8113-S1、Tca8113-S6與Tca8113-S10的ESA陽性表達(dá)率分別為60.7%±3.6%、74.1%±1.5%與65.3%±2.8%外，其余細(xì)胞亞系ESA的陽性表達(dá)率均在80%以上；各亞系CD44陽性表達(dá)率均很高，除了Tca8113-S7為68.9%±2.4%外，其余亞系的陽性率均在90%以上；12個(gè)亞系的CD184表達(dá)存在差異，陽性率在14.8%±3.5%至74.4%±1.5%之間波動(dòng)。
3 討論
本研究利用有限稀釋法等經(jīng)典的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，以舌癌Tca8113M1細(xì)胞系為研究對(duì)象，隨機(jī)選取192個(gè)舌癌細(xì)胞，在96孔板中進(jìn)行單細(xì)胞培養(yǎng)，經(jīng)過長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)，共建立12個(gè)舌癌Tca8113細(xì)胞亞系，比例為6.25%，而且都具備很強(qiáng)的成瘤性。進(jìn)一步檢測(cè)12個(gè)Tca8113細(xì)胞亞系的癌干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：CD44與ESA均為高水平表達(dá)，陽性表達(dá)率多在90%左右，而CD184的陽性表達(dá)率則各有不同。據(jù)此結(jié)果可以結(jié)合癌干細(xì)胞的生物學(xué)特性對(duì)本實(shí)驗(yàn)獲得的細(xì)胞系進(jìn)行分析。
本研究發(fā)現(xiàn)：舌癌Tca8113M1細(xì)胞系中有6.25%的單個(gè)細(xì)胞可以進(jìn)行自我分裂、增殖，形成細(xì)胞亞系。還有研究[3]發(fā)現(xiàn)：Tca8113細(xì)胞連續(xù)經(jīng)過兩次單細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，其中具備分裂增殖活性的細(xì)胞比例為5.09%～10.85%。這提示即使在永生化細(xì)胞系中，具備持續(xù)增殖能力的細(xì)胞占整個(gè)群體的比例都較少。根據(jù)目前的文獻(xiàn)[4]報(bào)道，在癌細(xì)胞群或組織中，癌干
細(xì)胞比例為0.01%～5%；體外培養(yǎng)的永生化癌干細(xì)胞系中，癌干細(xì)胞的比例可能偏高一些。本研究采用經(jīng)典的有限稀釋法獲取單個(gè)細(xì)胞，這種細(xì)胞表現(xiàn)出強(qiáng)大的增殖與分裂活力，而且還形成了成瘤性很強(qiáng)的細(xì)胞亞系。這些單個(gè)培養(yǎng)的細(xì)胞是否就是癌干細(xì)胞尚需進(jìn)行單細(xì)胞水平的鑒定，但可以大膽推測(cè)的是，其中應(yīng)該包含有癌干細(xì)胞。腫瘤干細(xì)胞的概念于20世紀(jì)60年代提出，并據(jù)此建立了腫瘤細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)。本研究在單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)中也發(fā)現(xiàn)，單細(xì)胞的增殖方式是克隆樣增殖，即形成一個(gè)細(xì)胞克隆后擴(kuò)大生長(zhǎng)，并且在周圍形成小的細(xì)胞克隆，最后融合成片，但究其細(xì)胞來源就是一個(gè)癌細(xì)胞而已，所有后續(xù)的細(xì)胞克隆與癌細(xì)胞就是源于它，所以可以認(rèn)為該細(xì)胞具有癌干細(xì)胞的潛質(zhì)，可以考慮從癌細(xì)胞系中篩選癌干細(xì)胞。
在12個(gè)Tca8113細(xì)胞亞系中，為明確其癌干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志的表達(dá)情況，為后續(xù)舌癌干細(xì)胞的篩選提供前期實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，本研究綜合文獻(xiàn)報(bào)道，選取了CD44、ESA與CD184等癌干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志進(jìn)行檢測(cè)。CD44是乳腺癌、頭頸部腫瘤、結(jié)腸癌等上皮組織的癌干細(xì)胞的相關(guān)標(biāo)志，CD184是胰腺癌干細(xì)胞的相關(guān)標(biāo)志；ESA則是上皮來源的癌干細(xì)胞標(biāo)志，而且屬于細(xì)胞黏附分子[5-6]。在本研究建立的12個(gè)細(xì)胞亞系中，
CD44與ESA均處于高水平表達(dá)，而CD184的表達(dá)則高低不一，其中亞系間均數(shù)差值最大者接近60%。從這3個(gè)指標(biāo)的表達(dá)情況來分析，可以進(jìn)行如下推測(cè)：1）CD44與ESA是不同細(xì)胞亞系共有的標(biāo)志，提示這些細(xì)胞亞系可能具有共同的組織起源；2）CD184的差異性表達(dá)提示Tca8113細(xì)胞系中存在細(xì)胞異質(zhì)性，但從其比例來看，大致有3個(gè)等級(jí)，即15%、30%、50%以上，提示其生物學(xué)特性可能有明顯的差別，但可作為舌癌干細(xì)胞研究的候選細(xì)胞群體進(jìn)行研究。
此外，在單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)上建立細(xì)胞亞系的過程中，筆者發(fā)現(xiàn)單個(gè)細(xì)胞形成細(xì)胞克隆的形態(tài)與細(xì)胞最后成系關(guān)系密切。在單個(gè)細(xì)胞形成完全克隆、部分克隆以及旁克隆等3種克隆形式中，只有完全克隆能夠形成細(xì)胞亞系，而且這些細(xì)胞亞系表現(xiàn)出腫瘤的異質(zhì)性與成瘤性，而部分克隆以及旁克隆則在傳代與擴(kuò)增培養(yǎng)過程中逐漸老化或消亡。這一結(jié)果可進(jìn)行逆向推理：將最初形成完全克隆的12個(gè)細(xì)胞確定為舌癌干細(xì)胞，而其形成的完全克隆則是癌干細(xì)胞自我更新與增殖的結(jié)果，其中可能富含癌干細(xì)胞。這一觀點(diǎn)也為前列腺癌、小鼠肉瘤、胰腺癌以及神經(jīng)膠質(zhì)瘤等相關(guān)研究[7-12]所證實(shí)。這些研究發(fā)現(xiàn)完全克隆細(xì)胞可以高表達(dá)癌干細(xì)胞標(biāo)志；接種1 000個(gè)完全克隆前列腺癌細(xì)胞就可形成移植瘤；通過懸浮球培養(yǎng)的癌細(xì)胞球在消化后進(jìn)行單細(xì)胞培養(yǎng)，可以形成高比例的完全克隆。有學(xué)者[13]進(jìn)一步在頭頸腫瘤細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)，CD133與CD44陽性表達(dá)的癌細(xì)胞多形成完全克隆，而CD133與CD44陰性的癌細(xì)胞則多趨向于形成部分克隆或旁克隆，從而認(rèn)為CD133與CD44是頭頸腫瘤癌干細(xì)胞的標(biāo)志。由此可見，完全克隆為癌干細(xì)胞的自我更新方式與富集、純化癌
干細(xì)胞及癌干細(xì)胞標(biāo)志的研究提供了新的途徑，近年在癌干細(xì)胞研究中逐漸被應(yīng)用和關(guān)注[11]。此外，針對(duì)完全克隆的研究切入時(shí)間與方式也需要注意。在本研究中，典型的完全克隆在單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)1～2周時(shí)形成，最好不要超過3周；擴(kuò)增培養(yǎng)后，可使癌干細(xì)胞比例減少或分化細(xì)胞比例增加，從而影響對(duì)癌干細(xì)胞行為學(xué)的觀察。
本研究屬于尋找舌癌干細(xì)胞的前期性和階段性實(shí)驗(yàn)，但是結(jié)果很有意義，這12個(gè)細(xì)胞亞系表明了Tca8113M1細(xì)胞系中有存在舌癌干細(xì)胞的可能性，而其最初的來源細(xì)胞系Tca8113也應(yīng)存在癌干細(xì)胞。結(jié)合細(xì)胞克隆形態(tài)分析的單個(gè)癌細(xì)胞培養(yǎng)模式可為深入研究舌癌干細(xì)胞提供細(xì)胞研究平臺(tái)。
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1978年，羅伯特•愛德華教授和同事一起成功地使第一例試管嬰兒誕生，從此開創(chuàng)了生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的新紀(jì)元。試管嬰兒在20多年前也曾被世界輿論界視為洪水猛獸而大加抨擊，但時(shí)至今日，這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)被全世界絕大多數(shù)國(guó)家承認(rèn)，堪稱醫(yī)學(xué)史上的一大奇跡。迄今為止，全球已有上百萬試管嬰兒誕生。
被譽(yù)為“試管嬰兒之父”的英國(guó)劍橋大學(xué)教授羅伯特•愛德華說：“克隆單純從技術(shù)上講非常簡(jiǎn)單，就是把卵細(xì)胞中DNA去掉，然后將體細(xì)胞中的DNA移入其中。這在世界上任何一個(gè)試管嬰兒實(shí)驗(yàn)室中都可以完成，困難在于如何降低克隆的危險(xiǎn)?！?/p>
本文以此熱點(diǎn)問題作為命題材料，對(duì)2011年高考生物試題進(jìn)行單項(xiàng)預(yù)測(cè)。預(yù)測(cè)材料及其涉及的知識(shí)、試題如下：
1．試管嬰兒
【知識(shí)鏈接】要做好有關(guān)“試管嬰兒”的試題，除了書本上的知識(shí)外，還要掌握“試管嬰兒”技術(shù)的有關(guān)知識(shí)?！霸嚬軏雰骸奔夹g(shù)是通過將不孕夫婦的和卵細(xì)胞取出在試管中完全受精，并在試管中培養(yǎng)使其發(fā)育到囊胚期，再將胚胎移入女性子宮內(nèi)使其發(fā)育成胎兒。
體外受精步驟包括：的采集與培養(yǎng)、卵母細(xì)胞的獲取與培養(yǎng)、體外受精等操作技術(shù)。具體過程如下圖:
哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育的過程大體概括如下圖：
例1 下列關(guān)于關(guān)試管嬰兒的說法，不正確的是（）
A. 從良種母牛體內(nèi)采集的卵母細(xì)胞都需要進(jìn)行體外培養(yǎng)
B. 從良種公牛采集的需進(jìn)行獲能處理
C. 早期胚胎移植的意義在于提高優(yōu)良母畜的繁殖率
D. 早期胚胎指的是由受精卵發(fā)育至原腸胚時(shí)期的胚
解析：本題考查了試管嬰兒的相關(guān)知識(shí)。根據(jù)體外受精和胚胎發(fā)育過程圖解可知，早期胚胎指的是由受精卵發(fā)育至囊胚時(shí)的胚。
答案：D
例2 據(jù)2008年1月17日《干細(xì)胞》雜志報(bào)道，某科學(xué)家使用了進(jìn)行試管受精的年輕女性捐獻(xiàn)的卵子，以及2名志愿者的皮膚成纖維細(xì)胞，成功克隆出了5個(gè)人體胚胎，進(jìn)而可以開發(fā)出有研究?jī)r(jià)值的干細(xì)胞。請(qǐng)回答：
（1）上述過程中主要應(yīng)用到的兩項(xiàng)動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)為；若將某經(jīng)過修飾的基因?qū)肫渲械牟糠峙咛ジ杉?xì)胞，常用的方法是。
（2）在使用合成培養(yǎng)基進(jìn)行胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，通常需要加入等天然成分；在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，要保證被培養(yǎng)的細(xì)胞處于一定的氣體環(huán)境，所需要的氣體主要有 。
（3）科學(xué)家欲進(jìn)行胚胎分割移植，則應(yīng)該選擇發(fā)育良好、形態(tài)正常的或囊胚，將其移入盛有操作液的培養(yǎng)皿中，然后用分割針進(jìn)行分割。
答案：（1）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞核移植顯微注射技術(shù)（法）
（2）血清（血清、血漿） 氧氣和二氧化碳 （3）桑葚胚
2．克隆人研究
【知識(shí)鏈接】克隆人的基本原理是動(dòng)物細(xì)胞核的全能性，包括胚胎細(xì)胞核移植和體細(xì)胞核移植。其基本過程為：
細(xì)胞核移植技術(shù)中注入去核卵母細(xì)胞中的不是供體細(xì)胞核，而是整個(gè)細(xì)胞，伴隨著兩細(xì)胞融合，體現(xiàn)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：具有一定的流動(dòng)性。該技術(shù)形成重組細(xì)胞繼而發(fā)育成一個(gè)新個(gè)體，體現(xiàn)了細(xì)胞核的全能性而非動(dòng)物細(xì)胞的全能性。
例3 下圖為克隆人的示意圖，據(jù)圖回答：
（1）圖中所涉及的現(xiàn)代生物技術(shù)有、和
等。
（2）下列有關(guān)胚胎移植的敘述正確的有（）
A.沖卵指的是從子宮中沖出胚胎，而非沖出卵子
B.只有供、受體生理環(huán)境高度一致，移入受體的胚胎才能被接受，并繼續(xù)發(fā)育
C.供體和受體要進(jìn)行免疫檢查，防止發(fā)生免疫排斥反應(yīng)
D.不同動(dòng)物其胚胎移植的時(shí)間不同，人的胚胎移植最好在四個(gè)細(xì)胞階段進(jìn)行
（3）圖中兩個(gè)嬰兒長(zhǎng)大后，外貌、性格和其他特征與原型男人相同，這說明 具有全能性。
（4）使用培養(yǎng)基進(jìn)行胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，通常要加入等天然成分，除了保證被培養(yǎng)細(xì)胞處于無菌、無毒及充足氧氣的環(huán)境中，還需要保證細(xì)胞生活所需的；早期胚胎發(fā)育在階段以前的細(xì)胞是全能細(xì)胞。
（5）圖中從“內(nèi)細(xì)胞團(tuán)到胚胎干細(xì)胞”的培養(yǎng)過程中，必須用處理內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，使之分散成單個(gè)細(xì)胞。干細(xì)胞形成組織、器官必須要進(jìn)行 和 。
（6）在體外培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞能否獲得動(dòng)物器官?
。為什么？
解析：（1）該圖利用了細(xì)胞核移植、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)、胚胎分割移植等技術(shù)。（2）沖卵一般是指是胚胎收集中的沖卵――胚胎、早期胚胎。供體和受體只有保證具有相同的生理狀態(tài)，才能保證胚胎的正常發(fā)育。（3）克隆過程說明動(dòng)物細(xì)胞核具有全能性。（4）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液的成分包括葡萄糖、氨基酸、無機(jī)鹽、維生素和動(dòng)物血清等。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的條件：無菌、無毒的環(huán)境；營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（合成培養(yǎng)基）；溫度和pH（36.5±0.5℃，7.2～7.4）；氣體環(huán)境（氧氣和二氧化碳）等。（5）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程常用胰蛋白酶處理組織，以使之分散成單個(gè)細(xì)胞。（6）胚胎干細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下一般只能增殖進(jìn)行細(xì)胞分裂，不能發(fā)生細(xì)胞分化。
答案：（1）核移植 胚胎移植 細(xì)胞培養(yǎng)（另外寫細(xì)胞融合、胚胎分割也對(duì)，寫了三個(gè)則給滿分）（2）ABD（3）動(dòng)物體細(xì)胞核 （4）血清 溫度和pH 桑葚胚（5）胰蛋白酶 細(xì)胞的分裂 分化 （6）不能 胚胎干細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下可以增殖而不發(fā)生分化
3．生物技術(shù)中的倫理問題
【知識(shí)鏈接】生物技術(shù)引發(fā)的倫理問題包括克隆技術(shù)引發(fā)的倫理問題、試管嬰兒引發(fā)的倫理問題、基因檢測(cè)引發(fā)的倫理問題。中國(guó)政府對(duì)于克隆技術(shù)的態(tài)度是禁止生殖性克隆人，不反對(duì)治療性克隆人；對(duì)于試管嬰兒的態(tài)度，中國(guó)衛(wèi)生部的規(guī)定是實(shí)施體外受精、胚胎移植及衍生技術(shù)必須獲得衛(wèi)生部的批準(zhǔn)證書。
例4下圖所示為人類“治療性克隆”的大致過程。請(qǐng)回答下列問題：
（1）圖中①為 細(xì)胞，過程A是目前實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞克隆的關(guān)鍵技術(shù)，該技術(shù)稱為 。
（2）圖中③能誘導(dǎo)分化出神經(jīng)細(xì)胞、血細(xì)胞、肌肉細(xì)胞，其根本原因是 的結(jié)果。這樣培育得到的組織器官進(jìn)行自體移植的最大好處是 。
（3）若應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)治療遺傳性糖尿病，可將健康人的控制胰島素合成的基因?qū)虢Y(jié)構(gòu)④中的
，原因是這些細(xì)胞 。
（4）在用PCR技術(shù)擴(kuò)增胰島素基因時(shí)，緩沖溶液中必須加入的物質(zhì)有：、分別與兩條模板鏈結(jié)合的兩種引物、 以及四種脫氧核苷酸。DNA的合成方向總是從子鏈的延伸。
（5）我國(guó)政府禁止生殖性克隆，但不反對(duì)治療性克隆研究。為什么要反對(duì)生殖性克?。纯寺∪耍┠兀空?qǐng)你寫出一條理由： 。
解析：從圖可以看才出，治療性克隆是將患者的體細(xì)胞的核與卵細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行重組， 形成重組細(xì)胞，將重組細(xì)胞經(jīng)過培養(yǎng)得到囊胚，取囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)得到不同組織器官，可用于進(jìn)行自體移植，不會(huì)產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)。
答案：（1）次級(jí)卵母（卵） 核移植
（2）基因選擇性表達(dá)不會(huì)產(chǎn)生排異（免疫排斥）反應(yīng)
關(guān)鍵詞： β細(xì)胞素; 糖尿病 胰腺干細(xì)胞
胰島移植是治療糖尿病的一個(gè)熱點(diǎn), 但供體的缺乏和存在免疫排斥反應(yīng)限制了其應(yīng)用。胰腺干細(xì)胞能定向分化成胰島細(xì)胞, 這為胰島移植提供了新的材料來源［1］。細(xì)胞生長(zhǎng)因子在干細(xì)胞的發(fā)育和分化中發(fā)揮了重要作用。研究表明, β細(xì)胞素（betacellulin, BTC）屬于表皮細(xì)
胞生長(zhǎng)因子家族中的一個(gè)成員, 具有多種生物學(xué)功能, 胰腺BTC mRNA的高水平表達(dá), 提示BTC可能在胰腺組織的發(fā)育中發(fā)揮重要的生理作用［2, 3］。本研究中通過建立穩(wěn)定的胰腺干細(xì)胞體外培養(yǎng)方法, 將β細(xì)胞素用于胰腺干細(xì)胞的體外培養(yǎng), 觀察其是否能促進(jìn)胰腺干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為成熟的胰島, 為克服胰島移植時(shí)的供體短缺提供新的胰島來源。
1 材料和方法
1.1 材料
SD大鼠（體質(zhì)量250 g, 雌雄不限, 飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物房自由飲水和進(jìn)食, 手術(shù)前1 d禁飲食）由第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心提供, Ⅴ型膠原酶、 Histopaque(1.119 kg/L)、Histopaque(1.098)(kg/L)、 Histopaque(1.077 kg/L)、 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(basic fibroblast growth factor 2, bFGF2)、 角朊細(xì)胞生長(zhǎng)因子(keratinocyte growth factor, KGF)、 ITS(insulintransferin selenium)購(gòu)自Sigma公司; 牛血清白蛋白(BSA) 購(gòu)自杭州四季青生物制品公司; 雙硫腙（dithizone, DTZ）、 二甲基亞砜（DMSO）、 煙堿購(gòu)
于華美公司; 兔抗小鼠的PDX1和CK19抗體購(gòu)自北京中山生物工程有限公司; 免疫組化SP檢測(cè)試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司; CMRL1066、 DMEM/F12 購(gòu)于Gibco公司; 胰島素放射免疫分析試劑盒購(gòu)于北京北方生物技術(shù)研究所; 大鼠β細(xì)胞素由本研究室采用基因工程方法獲得［4］。
1.2 方法
1.2.1 大鼠胰腺干細(xì)胞的分離、 培養(yǎng)
采用宋振順等［5］的方法, 首先以Ⅴ型膠原酶消化成年SD大鼠胰腺組織, 然后采用非連續(xù)密度梯度離
心法純化消化后的胰腺細(xì)胞, 去除胰島細(xì)胞后, 收集外分泌部細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。所獲的細(xì)胞培養(yǎng)在含100 mL/L胎牛血清的CMRL1066培養(yǎng)液中, 其中添加100 U/mL青霉素、 100 g/L鏈霉素、 500 μg/L二性霉素B。第3天將培養(yǎng)液改為DMEM/F12, 其中加入ITS（5 mU/L胰島素+5 mg/L轉(zhuǎn)鐵蛋白+5 mg/L硒）500 μg/L二性霉素B, 2 g/L牛血清白蛋白、 10 mmol /L煙堿, 0.01 ng/L KGF等。此后每2～3 d換液1次。于相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況和克隆形成情況。
1.2.2 胰腺干細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色
分別取培養(yǎng)3、 7、 14 d后的細(xì)胞爬片, 0.4 g/L多聚甲醛(PFA)固定后, PBS緩沖液沖洗玻片, 分別與兔抗小鼠PDX1、 CK19 抗體4℃反應(yīng)過夜, 二抗及呈色反應(yīng)參照SP試劑盒說明。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色, 顯微鏡觀察, 自來水沖洗, 蘇木精復(fù)染, 中性樹膠封固。陰性對(duì)照用PBS代替一抗。
1.2.3 雙硫腙染色與計(jì)數(shù)
雙硫腙(DTZ)為螯合劑, 可與鉛、 銅、 鋅等螯合, 人和動(dòng)物（豚鼠除外）的胰島β細(xì)胞因含有鋅, 雙硫腙染色呈猩紅色, 其他胰島細(xì)胞不著色。配制及染色方法: 用二甲基亞砜（DMSO）配制: DTZ 10 mg溶于10 mL DMSO, 用Hanks（pH7.8）1∶100稀釋, 0.22 μm濾膜過濾, DTZ與胰腺干細(xì)胞培養(yǎng)后轉(zhuǎn)分化形成的克隆混合, 室溫5～10 min后做鏡檢。按胰島的直徑>50 μm計(jì)數(shù)染色的胰島樣細(xì)胞團(tuán), <50 μm者不計(jì)。
1.2.4 胰島素檢測(cè)
胰腺干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化后形成的胰島克隆對(duì)葡萄糖刺激有胰島素分泌反應(yīng)。顯微鏡下挑取100個(gè)胰島樣細(xì)胞團(tuán)克隆, 培養(yǎng)于24孔培養(yǎng)板, 先用含低糖（5.5 mmol/L）的DMEM/F12培養(yǎng)液在37℃下孵育1 h后, 更換為含高糖（16.7 mmol/L）加煙堿（10 mmol/L）的DMEM/F12培養(yǎng)液在37℃下孵育2 h后, 取培養(yǎng)液上清, 采用放免法測(cè)定胰島素含量。
1.2.5 實(shí)驗(yàn)分組
按照實(shí)驗(yàn)方法1.2.1中胰腺干細(xì)胞的培養(yǎng)方法培養(yǎng)大鼠胰腺干細(xì)胞, 并將其設(shè)為正常對(duì)照組, 各實(shí)驗(yàn)組中分別加入不同濃度的大鼠β細(xì)胞素, 依次為10、 20、 30、 40、 50 mg/L, 共設(shè)立5個(gè)實(shí)驗(yàn)組。
1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
采用Student t檢驗(yàn)方法, 應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件完成統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
2 結(jié)果
2.1 成人胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞光鏡下形態(tài)學(xué)變化
干細(xì)胞是指具有自我更新能力和增殖分化能力的一類細(xì)胞，目前學(xué)習(xí)者對(duì)動(dòng)物干細(xì)胞的理論和應(yīng)用知識(shí)掌握較多。由于植物細(xì)胞的全能型，長(zhǎng)期以來很多學(xué)習(xí)者誤認(rèn)為植物中不存在干細(xì)胞，再加上教師對(duì)干細(xì)胞這部分內(nèi)容的講授不透徹，造成學(xué)習(xí)者對(duì)植物干細(xì)胞、動(dòng)物干細(xì)胞及植物愈傷組織細(xì)胞的概念往往混淆不清，存在植物干細(xì)胞認(rèn)知上的錯(cuò)誤，因此很有必要對(duì)植物干細(xì)胞的相關(guān)知識(shí)進(jìn)行總結(jié)。
1.植物干細(xì)胞
1.1植物干細(xì)胞的概念和特征。植物干細(xì)胞是位于植物分生組織中固有的未分化細(xì)胞，具有自我更新和再生能力。植物干細(xì)胞具有很強(qiáng)的自我更新能力，并且可以分化為特化的細(xì)胞類型，這些特化的細(xì)胞產(chǎn)生新的植物器官（根、莖、葉和花等）。這些細(xì)胞表型的變化是由影響植物功能的基因表達(dá)變化引起的，受到內(nèi)源性和外源性的信號(hào)共同調(diào)節(jié)[1]。植物干細(xì)胞的特征包括：能夠形成所有分化細(xì)胞的類型；具有自我更新的能力，維持干細(xì)胞的數(shù)量；位于分生組織。
1.2植物干細(xì)胞與動(dòng)物干細(xì)胞的比較。在動(dòng)物中，通常將干細(xì)胞分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞具有全能性，它可以分化形成所有的成體組織細(xì)胞，甚至發(fā)育成為完整的個(gè)體；成體干細(xì)胞（如造血干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、皮膚干細(xì)胞等）大多為多能干細(xì)胞，它們具有多向分化的潛能，可以分化形成除自身組織細(xì)胞外的其他組織細(xì)胞，真正具有全能性的細(xì)胞是受精卵和其分裂產(chǎn)生的子細(xì)胞。與此相比，許多植物干細(xì)胞具有旺盛的再生能力，在干細(xì)胞的整個(gè)生活周期中能使植物生長(zhǎng)并且產(chǎn)生新的器官（如植物莖端分生組織中的干細(xì)胞和根端分生組織中的干細(xì)胞）[2]。
1.3植物干細(xì)胞與植物愈傷組織細(xì)胞的比較。植物愈傷組織細(xì)胞是由成體細(xì)胞經(jīng)過脫分化而形成的具有分化能力的細(xì)胞，雖然愈傷組織的分化能力與植物干細(xì)胞相似，但它們?cè)趤碓?、?xì)胞分化和增值能力等方面是不同的。植物愈傷組織細(xì)胞來源于異質(zhì)性的體細(xì)胞，它是體細(xì)胞對(duì)損傷的暫時(shí)響應(yīng)，是一個(gè)臨時(shí)獲得刺激的細(xì)胞，盡管愈傷組織具有干細(xì)胞樣屬性，但愈傷組織不易維持穩(wěn)定的細(xì)胞分裂[3]。而植物干細(xì)胞來源于植物分生組織的同質(zhì)性細(xì)胞，它們?cè)谥参锏恼麄€(gè)生命周期可以產(chǎn)生并形成新的組織和器官。
2.植物干細(xì)胞的類別與調(diào)控
根據(jù)分生組織的種類，植物干細(xì)胞可分為莖尖分生組織中的干細(xì)胞和根尖分生組織中的干細(xì)胞。
2.1莖尖分生組織中的干細(xì)胞。莖尖分生組織包括中心區(qū)和中心區(qū)下方的帶狀區(qū)。中心區(qū)包括上部干細(xì)胞區(qū)和下部的組織中心（即干細(xì)胞區(qū)下部靠近帶狀區(qū)的小細(xì)胞群）。干細(xì)胞分裂時(shí)上部的干細(xì)胞分裂成兩部分子細(xì)胞，一部分干細(xì)胞后裔留在中心區(qū)并保持多能性；另一部分細(xì)胞則離開莖尖分生組織的中心區(qū)，但保持較快的分裂速度，最終分化為葉或者花原基器官，為側(cè)生器官的生長(zhǎng)和分化提供保證[4]。目前已知的位于干細(xì)胞周圍“組織中心”的WUS（WUSCHEL）是保持莖尖干細(xì)胞特征的必要信號(hào)分子，它參與對(duì)莖尖干細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)調(diào)控，使整個(gè)植物莖尖干細(xì)胞保持連續(xù)不斷的自我更新和分化。
2.2根尖分生組織中的干細(xì)胞。靜止中心位于根尖分生組織中心，干細(xì)胞則圍繞在靜止中心細(xì)胞周圍。靜止中心作為組織中心維持周圍干細(xì)胞的穩(wěn)定和功能，靜止中心周圍的干細(xì)胞分布于中柱鞘外側(cè)，維管干細(xì)胞形成維管組織、皮層/內(nèi)皮層干細(xì)胞，進(jìn)而形成皮層、內(nèi)皮層與根冠干細(xì)胞，然后形成根冠細(xì)胞。目前已知的WOX5（WUS-RELATED HOMEOBOX 5）作為最主要的干細(xì)胞決定因子，特異的表達(dá)于根端分生組織的靜止中心，參與對(duì)根端干細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)調(diào)控，使整個(gè)植物的根尖干細(xì)胞保持連續(xù)不斷的自我更新和分化[4]。
3.植物干細(xì)胞的應(yīng)用
3.1生產(chǎn)天然產(chǎn)物，開發(fā)藥品或者化妝品。傳統(tǒng)的植物細(xì)胞培養(yǎng)存在細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢、生產(chǎn)成本高等問題，而植物干細(xì)胞培養(yǎng)具有遺傳穩(wěn)定、細(xì)胞生長(zhǎng)率和生長(zhǎng)模式穩(wěn)定、凝集程度低等優(yōu)點(diǎn)，可以用來大量生產(chǎn)有用的植物天然產(chǎn)物，并用于藥品、功能性食品、化妝品中。如懸浮培養(yǎng)紫杉干細(xì)胞可以生產(chǎn)松香烷型三環(huán)二萜、美麗紅豆杉素A和美麗紅豆杉素B等產(chǎn)物，以達(dá)到抑制腫瘤血管的生成和抗癌作用，而且其產(chǎn)值遠(yuǎn)大于傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)的產(chǎn)值，具有很好的開發(fā)前景[5]。
3.2植物細(xì)胞系庫(kù)的建立和利用。一般的植物細(xì)胞凍存后存活率低，恢復(fù)生長(zhǎng)能力慢，因此限制其在植物細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用。植物干細(xì)胞系在低溫儲(chǔ)藏方面有很大的優(yōu)勢(shì)，不僅有高的存活率，而且在低溫儲(chǔ)藏前后遺傳物質(zhì)沒有變異，是植物細(xì)胞系庫(kù)建立的很好材料。細(xì)胞系庫(kù)的建立不僅會(huì)使研究材料的供應(yīng)得到滿足，而且使植物細(xì)胞系的研究周期縮短，并在植物種子資源的保存和利用方面發(fā)揮重要作用[6]。除了以上應(yīng)用外，利用植物干細(xì)胞還可以進(jìn)行植物干細(xì)胞的分子調(diào)控機(jī)制和分子設(shè)計(jì)育種等方面的研究。
4.結(jié)語
植物干細(xì)胞是位于植物分生組織中固有的未分化細(xì)胞，它們具有自我更新和再生能力。根據(jù)目前學(xué)習(xí)者對(duì)植物干細(xì)胞認(rèn)識(shí)不足的實(shí)際，本文對(duì)植物干細(xì)胞、動(dòng)物干細(xì)胞及植物愈傷組織細(xì)胞的概念進(jìn)行了辨析，并對(duì)植物干細(xì)胞的分類及應(yīng)用進(jìn)行了論述。學(xué)習(xí)者清楚植物干細(xì)胞、植物愈傷組織細(xì)胞和動(dòng)物干細(xì)胞的概念后，在學(xué)習(xí)植物干細(xì)胞的理論和應(yīng)用等方面時(shí)才能正確理解相關(guān)的知識(shí)點(diǎn)。
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【關(guān)鍵詞】 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；肝干細(xì)胞；細(xì)胞移植
骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs) 具有多向分化潛能，可以在體外誘導(dǎo)分化出肝干細(xì)胞，此種骨髓源性肝干細(xì)胞可以為肝組織移植工程提供新的細(xì)胞來源。近年來的研究主要集中于體外誘導(dǎo)MSCs為肝干細(xì)胞，此種細(xì)胞具備了肝細(xì)胞的形態(tài)，在體外能夠表現(xiàn)出一定的肝細(xì)胞功能〔1〕，但對(duì)骨髓源性肝干細(xì)胞在體內(nèi)的定居和定位能力情況尚不明確。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)大鼠MSCs進(jìn)行體外培養(yǎng)，誘導(dǎo)、分化出肝干細(xì)胞，同時(shí)建立暴發(fā)性大鼠肝衰竭模型，探討骨髓源性肝干細(xì)胞同種異體移植后在受體大鼠模型肝內(nèi)定居情況。
1 材料與方法
1.1 材料
低糖DMEM培養(yǎng)基(Invitrogen)、Percoll(Pharmacia，比重1.077 g/L)(Gibco公司)、胎牛血清(杭州四季青)、胰蛋白酶2(Sigma)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF)(CYTOALAB公司)、細(xì)胞培養(yǎng)箱(Forma公司)；純系SD大鼠、3周齡、體重100～120 g(供體大鼠)和成年純系SD雌性大鼠、體重180～220 g(受體大鼠)，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
1.2 骨髓源性肝干細(xì)胞培養(yǎng)
1.2.1 MSCs分離、培養(yǎng)及定向肝干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化
從供體SD大鼠股骨提取骨髓細(xì)胞。用比重1.073的Percoll分離液行MSCs分離，加含抗生素及10%小牛血清的IMDM培養(yǎng)和擴(kuò)增，取第3代MSCs加入HGF(20 μg/L)誘導(dǎo)定向肝干細(xì)胞分化。
1.2.2 誘導(dǎo)后的骨髓源性肝干細(xì)胞鑒定
用ELASA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中的甲胎蛋白（AFP)、白蛋白（ALB)。用免疫組化法檢測(cè)細(xì)胞中細(xì)胞角化蛋白（CK)18、CK19和波形蛋白（Vimentin)的表達(dá)。
1.3 肝損傷動(dòng)物模型的制作和分組
受體雌性SD大鼠20只，隨機(jī)分為正常大鼠組和肝損傷組。肝損傷組用質(zhì)量濃度10%D氨基半乳糖溶液一次腹腔內(nèi)注射，劑量1 200 mg/kg體重。
1.4 同種異體大鼠骨髓源性肝干細(xì)胞移植
正常組大鼠和肝損傷組大鼠，分別以戊巴比妥麻醉，仰臥位固定，常規(guī)消毒、備皮、鋪無菌巾，上腹正中切口，長(zhǎng)約1 cm，于肝中葉以BD胰島素注射器注射肝干細(xì)胞懸液0.4 ml（107/ml )，觀察無出血后縫合傷口。
1.5 受體體內(nèi)移植骨髓源性肝干細(xì)胞鑒定
應(yīng)用PCR技術(shù)檢測(cè)性別決定因子基因片段(sex determining region of the Y，Sry)。干細(xì)胞移植后1，2，4 w后取受體肝臟移植原位(注射部位)、鄰位(距注射部位0.5 cm)組織，應(yīng)用PCR技術(shù)檢測(cè)〔2〕性別決定因子基因片段(Sry)。引物按文獻(xiàn)〔3〕設(shè)計(jì)，由上海Casarry生物有限公司合成序列，外引物對(duì)SRY1/ SRY2擴(kuò)增片段大小為317 bp，內(nèi)引物對(duì)SRY3/SRY4擴(kuò)增片段大小為121 bp。
2 結(jié) 果
2.1 骨髓源性肝干細(xì)胞的培養(yǎng)結(jié)果 大鼠MSCs經(jīng)原代培養(yǎng)，細(xì)胞傳代，誘導(dǎo)分化，細(xì)胞異形性較誘導(dǎo)前增加，表現(xiàn)為圓形、橢圓形細(xì)胞數(shù)量較誘導(dǎo)前明顯增加，而梭形細(xì)胞數(shù)量減少，誘導(dǎo)培養(yǎng)10 d左右，細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)為圓形、橢圓形細(xì)胞為主，梭形細(xì)胞已極少見。免疫組化染色，二氨基聯(lián)苯胺（DAB)顯色，在倒置顯微鏡下，可見細(xì)胞形狀顯圓形或卵圓形，胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。CK18、CK19、Vimentin呈陽性表達(dá)。細(xì)胞培養(yǎng)液中AFP、ALB含量誘導(dǎo)前分別為(0.021±0.008) ng/ml和(0.72±0.14) g/L；誘導(dǎo)后分別為(0.403±0.042) ng/ml，(6.1±0.32) g/L。誘導(dǎo)后的AFP、ALB含量明顯高于誘導(dǎo)前（P＜0.05)。表明經(jīng)誘導(dǎo)的MSCs分化為肝干細(xì)胞。見圖1。
2.2 肝損傷模型病理結(jié)果
D氨基半乳糖注射后，大鼠肝臟肝索紊亂，肝細(xì)胞腫脹變性、灶性及大片壞死，伴出血及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。見圖2。
2.3 性別決定因子基因片段檢測(cè)結(jié)果
肝損傷組：檢測(cè)1 w時(shí)陰性，2 w時(shí)原位肝組織Sry陽性表達(dá)，鄰位未表達(dá)，而4 w時(shí)原位及鄰位組織檢測(cè)到Sry表達(dá)，原位表達(dá)較2 w時(shí)增強(qiáng)，鄰位較弱。正常肝臟組：1及2 w均未檢測(cè)到表達(dá)，4 w時(shí)檢測(cè)到原位微弱表達(dá)。見圖3。
3 討 論
MSCs具有多向分化潛能，特別是具有向肝臟干細(xì)胞、肝細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的潛能〔4〕，因而有望成為肝組織移植工程新的種子細(xì)胞來源。由于MSCs是成體干細(xì)胞，取材方便，可以來自患者自身，無排斥反應(yīng)，故具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道〔5〕，使用HGF，使MSCs分化為肝干細(xì)胞，對(duì)骨髓源性肝干細(xì)胞同種異體移植后在受體大鼠模型肝內(nèi)定居情況進(jìn)行初步研究。
目前研究表明移植肝干細(xì)胞可存活于受體許多部位包括肝、脾、腹腔、胰腺、肺、腸系膜、腎及腎脂肪囊、腹膜后等部位〔2，6～8〕。肝臟由于其獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境、生理及解剖結(jié)構(gòu)環(huán)境無疑是最理想的場(chǎng)所，可經(jīng)門靜脈輸入或肝實(shí)質(zhì)植入，該組實(shí)驗(yàn)采用肝臟植入方法，取得較好效果，說明此方法是安全可行的。本實(shí)驗(yàn)采用同種異體移植，應(yīng)該考慮免疫排斥反應(yīng)，但文獻(xiàn)報(bào)道，純化的MSCs具有獨(dú)特的免疫原性，進(jìn)行同種異體移植不需要預(yù)先應(yīng)用免疫抑制劑，無免疫排斥反應(yīng)，是良好的基因治療靶細(xì)胞。
目前鑒定受體體內(nèi)被移植后的肝干細(xì)胞有許多方法，其中較為常用的是以雄性動(dòng)物為肝干細(xì)胞供體〔1〕，雌性動(dòng)物接受細(xì)胞移植后，分化增殖的細(xì)胞 Y 染色體陽性，證明雌性受體內(nèi)存活的細(xì)胞來自雄性供體細(xì)胞，這就可以清楚地將植入的細(xì)胞與原有的細(xì)胞區(qū)分開來，進(jìn)一步研究移植作用，本實(shí)驗(yàn)采用雄性供體細(xì)胞為雌性受體移植，檢測(cè)移植部位細(xì)胞的Y染色體表達(dá)情況，進(jìn)而檢測(cè)移植細(xì)胞是否定植。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，移植后2 w肝衰竭大鼠移植原位檢測(cè)到表達(dá)，4 w表達(dá)明顯增強(qiáng)，而且臨近部位出現(xiàn)表達(dá)；正常大鼠在移植后4 w移植原位出現(xiàn)微弱表達(dá)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，骨髓源性肝干細(xì)胞在正常大鼠肝臟及肝損傷大鼠肝臟內(nèi)均能定居，但在肝損傷大鼠肝臟內(nèi)定居能力明顯增強(qiáng)。考慮可能為大鼠肝損傷后，刺激機(jī)體分泌出各種促進(jìn)肝細(xì)胞再生的生長(zhǎng)因子，為移植細(xì)胞提供定居所需的微環(huán)境。文獻(xiàn)報(bào)道，在正常大鼠體內(nèi)，HGF等因子的活性是被抑制的，只有在肝損傷時(shí)，啟動(dòng)肝再生程序，這些因子才能被激活，引起肝細(xì)胞有絲分裂。
本文通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)了大鼠骨髓源性肝干細(xì)胞移植后可以定居于受體肝臟內(nèi)，而且在肝損傷后有利于干細(xì)胞移植的定居，這為下一步研究定居于肝內(nèi)的骨髓源性肝干細(xì)胞的功能奠定了基礎(chǔ)。
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